晏　容， 劉　云， 賀莉芳， 楊雪峰， 劉　流， 李曉飛

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州，遵義563003）

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斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 ERK 1/2通路和G2/M期調(diào)控蛋白的影響

晏容1， 劉云2， 賀莉芳1， 楊雪峰3， 劉流1， 李曉飛1

（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563003；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州，遵義563003）

摘要：目的 探討斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路和周期相關(guān)蛋白的影響。方法 將不同濃度的斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721，免疫印跡法檢測(cè)ERK1/2通路和周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，0.895、1.79 μmol/L濃度組的ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯下降，同時(shí)周期相關(guān)蛋白Cdc25C、Cdc2表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)論 推測(cè)斑蝥素酸鎂可能是通過(guò)抑制ERK1/2通路，進(jìn)而調(diào)控Cdc25C、Cdc2的表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：斑蝥素酸鎂；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721；ERK1/2通路；Cdc25C；Cdc2

課題組前期通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（ITRAQ）技術(shù)研究斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2蛋白質(zhì)組差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，ERK1/2表達(dá)量呈顯著下調(diào)趨勢(shì)。提示ERK1/2通路可能在斑蝥素酸鎂抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。研究表明，ERK1/2信號(hào)通路與多種細(xì)胞周期蛋白的變化有關(guān)［1］，前期研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂在體內(nèi)外均可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，并能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其凋亡的發(fā)生與G2/M期阻滯有關(guān)。具體機(jī)制是否由于ERK1/2信號(hào)通路發(fā)生異常進(jìn)而調(diào)控G2/M期周期相關(guān)蛋白出現(xiàn)變化，最終導(dǎo)致G2/M期發(fā)生阻滯，目前尚不清楚。因此，本研究選取人肝癌細(xì)胞SMMC-7721作為靶細(xì)胞，探討斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 ERK1/2通路和G2/M期調(diào)控蛋白的影響，初步明確斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抗癌機(jī)制。

1 材料

1.1 斑蝥素酸鎂的制備［2］在50 mL的三角燒瓶中加入斑蝥素純品1 g，加入30 mL三氯甲烷溶液，加熱使其溶解，同時(shí)取氫氧化鎂0.2 g加30 mL蒸餾水制成懸濁液；將氫氧化鎂懸濁液加入到溶解斑蝥素的三氯甲烷溶液中，磁力攪拌24 h后加熱到60℃，將三氯甲烷揮干，過(guò)濾，得白色懸浮液；置烘箱中濃縮，干燥，得白色結(jié)晶粉末；將30 mL的三氯甲烷加入到白色結(jié)晶粉末中，加熱到40℃恒溫2 h，使斑蝥素溶解，過(guò)濾，干燥，得白色結(jié)晶粉末即為斑蝥素酸鎂純品，其含有量在90％以上。

1.2 肝癌細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；南美胎牛血清、胰蛋白酶為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Anti-Cdc25C antibody ［TC-19］、Anti-ERK1 +ERK2 antibody、Anti-ERK1（phospho Y204）+ERK2（phospho Y187）antibody購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Cdc2 p34 Antibody（17）購(gòu)自美國(guó)Santa公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜、發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其他常用生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；mini protean 3 cell電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；SP-9型電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自大連競(jìng)邁生物科技有限公司。

2 方法

2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，最終將細(xì)胞懸液按1×105/mL密度接種于6孔板中，37℃、5％CO2培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 培養(yǎng)20 h后棄上清，再加入配置好的斑蝥素酸鎂，藥物終濃度為1.79、0.895、0.224 μmol/L，對(duì)照組加等量的培養(yǎng)基；37℃、5％CO2培養(yǎng)48 h。

2.3 Western blot法 棄上清，細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗2次；每6孔板加入250 μL的RIPA細(xì)胞裂解液（含終濃度為1 mmol/L的PMSF蛋白酶抑制劑），冰上裂解20 min；細(xì)胞充分裂解后，收集細(xì)胞于EP管中，4°C、12 000 r/mim離心10 min；收集上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。20 μg提取的蛋白樣品行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入按抗體說(shuō)明書(shū)推薦比例稀釋后的一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜3次，每次10 min，加入二抗工作液，PBS洗2次，每次10 min，浸于適量ECL化學(xué)發(fā)光試劑中1 min，取出室溫條件下干燥并用保鮮膜包置于暗盒中，壓片曝光。利用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。磷酸化蛋白的相對(duì)含有量=磷酸化目的蛋白條帶灰度值/總目的蛋白條帶灰度值；蛋白的相對(duì)含有量=目的蛋白的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，SPSS 13.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1/2的蛋白表達(dá)以及蛋白磷酸化表達(dá)的影響 采用Western blot檢測(cè)不同濃度斑蝥素酸鎂作用于SMMC-7721肝癌細(xì)胞后，ERK1/2的蛋白表達(dá)以及蛋白磷酸化表達(dá)。結(jié)果顯示，0.224 μmol/L濃度組ERK1/2蛋白的磷酸化水平與對(duì)照組比較，沒(méi)有明顯變化（p> 0.05）；0.895、1.79 μmol/L濃度組ERK1/2蛋白的磷酸化水平與對(duì)照組比較，明顯下調(diào)（p <0.01）；但總的ERK1/2蛋白表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生變化（圖1～2）。提示低濃度組的斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1/2通路的影響不明顯，但是當(dāng)濃度達(dá)到0.895 μmol/L時(shí)ERK1/2通路受到顯著抑制。

1.對(duì)照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖1　ERK 1/2蛋白以及蛋白磷酸化的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，**p<0.01圖2　斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)的影響

3.2 斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc25C蛋白表達(dá)的影響 斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc25C蛋白表達(dá)的影響如圖3～4所示。0.224 μmol/L濃度組Cdc25C蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，沒(méi)有明顯變化（p>0.05）；0.895、1.79 μmol/L濃度組Cdc25C蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，明顯下調(diào)（p<0.01）。

1.對(duì)照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖3　Cdc25C蛋白的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，**p<0.01圖4　斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc25C蛋白表達(dá)的影響

3.3 斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc2蛋白表達(dá)的影響 斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc2蛋白表達(dá)的影響如圖5～6所示。與對(duì)照組比較，0.224 μmol/L濃度組Cdc2蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化（p> 0.05），0.895、1.79 μmol/L濃度組Cdc2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，明顯下調(diào)（p<0.01）。

1.對(duì)照組 2.斑蝥素酸鎂（0.224 μmol/L）組 3.斑蝥素酸鎂（0.895 μmol/L）組 4.斑蝥素酸鎂（1.79 μmol/L）組圖5　Cdc2蛋白的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，**p<0.01圖6　斑蝥素酸鎂對(duì)Cdc2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是上世紀(jì)80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，是傳遞絲裂原信號(hào)的信號(hào)蛋白［4］。蛋白ERK1/2是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，屬于MAPK家族成員，是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，ERK1/2參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂等一系列生理過(guò)程，其異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生中起重要作用［5-6］。已在肝癌、前列腺癌等多種腫瘤中，檢測(cè)到ERK1/2信號(hào)通路異常明顯活化，其可激活一系列胞質(zhì)蛋白，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［7］。國(guó)外學(xué)者David等［8］發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中，ERK1/2的磷酸化水平顯著增加，抑制其磷酸化后，卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，低濃度組的斑蝥素酸鎂對(duì)ERK1/2蛋白磷酸化水平?jīng)]有影響，隨著濃度的增加ERK1/2蛋白磷酸化水平逐漸下調(diào)，而總體的ERK1/2蛋白表達(dá)卻無(wú)明顯變化。提示ERK1/2通路的抑制可能在斑蝥素酸鎂抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。

G2/M期是細(xì)胞增殖的主要調(diào)控點(diǎn)［9］。其中Cdc2是特異性調(diào)控G2/M期的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，是G2/M期調(diào)控的關(guān)鍵，其活性受到多種因子的調(diào)控。其中，Cdc25C是調(diào)節(jié)Cdc2活性的關(guān)鍵酶，能夠使Cdc2的p-Cdc2 （Tyr15），Tyr14脫磷酸化從而激活Cdc2，激活的Cdc2使細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期。同時(shí)，ERK1/2又與多種細(xì)胞周期蛋白的變化有關(guān)，如Cdc25C的活性受ERK1/2的調(diào)控，在G2/M期ERK1/2激酶直接激活Cdc25C［10］，相反ERK1/2的耗竭致使Cdc25C表達(dá)下調(diào)［11］。Ye等［12］研究表明，氧化吲哚的衍生物XJW20通過(guò)下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，致使Cdc25C活性下降引起Cdc2表達(dá)降低，最終細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。本實(shí)驗(yàn)與Ye等的研究結(jié)果相似。因此，我們推測(cè)斑蝥素酸鎂可能是通過(guò)抑制ERK1/2通路，進(jìn)而調(diào)控Cdc25C活性下降導(dǎo)致Cdc2的表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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作者簡(jiǎn)介：晏 容（1978—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)槔ハx(chóng)資源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail：yanr3725881994@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81560669）；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字［2012］3082）；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字［2011］3031）；匯川區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（E-114）

收稿日期：2015-03-31

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.038

中圖分類號(hào)：R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1141-03