魏明剛， 楊彥裕， 陳　琳， 毛葉琴， 程宗琦， 費　梅， 熊佩華， 繆麗燕

（蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006）

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基于細胞信號通路機制探討芪歸益腎方劑延緩腎臟纖維

魏明剛， 楊彥裕， 陳琳， 毛葉琴， 程宗琦， 費梅， 熊佩華， 繆麗燕

（蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇蘇州215006）

摘要：目的 利用單側輸尿管梗阻腎病模型，研究芪歸益腎方劑（芡實、金櫻子、黃芪等）通過調控細胞信號通路TGF-β/Smads/ILK/GSK-3的表達延緩腎臟纖維化。方法 實驗動物分為假手術組、模型組、洛丁新組和芪歸益腎組。通過單側輸尿管梗阻（UUO）腎病模型干預并進行腎組織的病理學和分子生物學分析，明確細胞信號通路TGF-β/ Smads/ILK/GSK-3的表達變化情況。結果 應用藥物干預后的腎臟組織的病理學分析表明，通過分析系膜基質指數和腎小管間質指數，UUO小鼠腎臟組織纖維化程度減輕，相對于模型組，組間比較有顯著差異（p<0.05），芪歸益腎組的效果優(yōu)于洛丁新組（p<0.05）；應用RT-PCR及Western blot檢測轉化生長因子-β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、整合素連接激酶（ILK）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），進一步證實細胞信號通路與纖維化之間的關系密切。結論 芪歸益腎方劑可以減輕UUO腎病模型的纖維化病變程度，其作用機制可能與調控細胞信號通路TGF-β/ Smads/ILK/GSK-3的表達相關。

關鍵詞：芪歸益腎方劑；細胞信號通路；腎臟纖維化

單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎病模型是研究腎臟纖維化的經典病理模型之一，腎臟纖維化是腎臟病變發(fā)展至腎衰竭的共同病理學機制。主要表現為細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）的代謝異常，同時大量成纖維細胞增生，ECM代謝異常、合成增加和降解減少導致腎小管間質纖維化，進而導致腎小球功能逐漸喪失［1］。研究發(fā)現，腎臟纖維化的病理過程與很多細胞因子的細胞信號調控密切相關。結合課題組的前期研究基礎，我們認為糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）在整合素連接激酶（integrin-link kinase，ILK）的作用下對ECM的代謝作用值得我們關注。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 體質量18～20 g的SFP級雄性BALB/c小鼠，由上海斯萊克實驗動物中心提供［SCXK（上海）2012-0002］。

1.2 實驗藥物 芪歸益腎方劑購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，包括芡實、金櫻子、黃芪、太子參、白術、當歸、川芎、牛膝、白花蛇舌草、蟬蛻和甘草11味藥物，并經程宗琦主任藥師鑒定為正品藥材。在蘇州大學附屬第一醫(yī)院制劑室將中藥藥物按照一定的比例煎煮，最終將藥液調整為藥物質量濃度為1 g/mL的溶液。洛丁新片（10 mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號x2556）。

1.3 實驗相關的主要試劑及儀器 TGF-β1、Smad3、FN、 GAPDH、ILK和GSK-3β一抗（貨號分別為ab-53169、ab-28379、ab-131065、ab-9485、ab-52480、ab-75745）、二抗goat anti-rat IgG（貨號ab-6741）為英國Abcam公司產品；RT-PCR試劑盒為美國Promega公司產品（貨號A3500）；dNTPs（貨號CBF4901A）、MgCl2（貨號AB401A）、rTaq PCR聚合酶（貨號DR100AM）、PCR DL2000 Marker（貨號D501A）為日本TAKARA公司產品；DEPC（美國Amresco公司分裝，E174）；Tris-base（美國Amresco公司分裝，D0194）；臺式高速冷凍離心機（美國Beckman Avanti J-30I）；超低溫冰箱（MDFU-53V，日本SANYO公司）；核酸蛋白定量儀（德國Eppendorf公司）；PCR擴增儀（Hybaid Express，英國Hybaid公司）；EC250-90型電泳儀（美國EC公司）；Alpha Imager 2000凝膠圖象系統(tǒng)（美國Alpha公司）；灰度分析使用由美國NIH提供的Image J軟件進行。

2 實驗方法

2.1 模型的制備及分組方法 32只小鼠根據隨機數字表法隨機分為假手術組、模型組、洛丁新組和芪歸益腎組，適應飼養(yǎng)1周后開始實驗。UUO模型的制備方法為2％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，在固定器上固定，腹部消毒，沿腹正中線切開皮膚、皮下組織及腹膜，充分暴露左側腎臟及輸尿管，游離輸尿管后以5-0號手術線做結扎，生理鹽水沖洗后關腹并逐層縫合腹膜及皮膚，完成手術。假手術組僅以手術線穿過輸尿管，余步驟與手術組相同。術后第2天開始灌胃。

2.2 給藥方法 灌胃混懸液按照臨床患者的常規(guī)劑量與小鼠用藥的換算關系，確定小鼠灌胃的中等劑量。然后，按照0.5～2倍的劑量確定高、中、低3個劑量組進行預實驗，結合研究結果確定最終使用劑量［2］，結合藥物質量濃度按照1 mL/100 g體質量配制灌胃藥物；假手術組、模型組均按體質量同樣以1 mL/100 g灌服0.9％生理鹽水。以開始灌胃記為實驗第1天，第7天將小鼠頸椎脫臼處死，快速剖取左腎進行相應的病理學和分子生物學檢測。動物實驗的過程由蘇州大學倫理學委員會批準。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 腎組織一般病理學 腎組織在10％的福爾馬林溶液中固定處理后行HE染色，石蠟包埋切片厚度2 μm。通過對HE切片計算腎小球基質面積（Ms）和腎小球面積（Gs），計算兩者之間的比例確定各組大鼠腎臟系膜基質指數；對腎小管間質病變通過腎小管間質病變指數評分根據病變范圍及嚴重程度，分別以0、1、2、3分代表正常、輕度、中度和重度，腎小管間質病變指數包括間質單核細胞浸潤、間質纖維化及腎小管萎縮［3］。

2.3.2 免疫組織化學 腎組織切片冷丙酮固定、分別加入一抗和二抗，DAB顯色，封固后觀察。觀察方法以棕色或者棕褐色著色面積作為陽性面積。在400倍光學顯微鏡下每個組織切片采集10個不重疊視野中的陽性染色面積，對腎臟組織切片化學染色的面積和整個視野面積的結果進行統(tǒng)計，應用計算機醫(yī)學病理圖象分析系統(tǒng)分析后計算染色區(qū)域的平均光密度數值。

2.3.3 腎臟組織分子生物學的檢測 Tgfb1、Fn、IlK和GsK3b的引物序列是根據網上NCBI數據庫中各自基因序列設計獲得，由上?？党缮锛夹g有限公司合成。RT-PCR實驗具體操作參見課題組已經發(fā)表的相關文獻［4］。

RT-PCR檢測核酸（mRNA）表達。取各組小鼠腎組織采用一步法抽提總RNA，以分光光度法測RNA含有量與純度后，在-80℃環(huán)境中保存。使用試劑盒進行逆轉錄cDNA。凝膠圖象系統(tǒng)對凝膠進行拍照，并使用光密度分析法進行數據分析，以GaPdh作為內參并與之對照，數值以灰度分析比值表示。

Western blot檢測腎皮質蛋白表達：取各組大鼠腎皮質，用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液在研磨器中研磨，離心取上清液。進行凝膠電泳濕轉儀濕轉至硝酸纖維素膜。室溫封閉1 h并加一抗過夜后，加羊抗兔IgG室溫反應2 h，在X光片上曝光，顯影、定影、沖洗晾干后掃描蛋白條帶。以GAPDH為內參，采用灰度分析法進行數據分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件處理。各組數據均數采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關分析采用Pearson相關。

3 實驗結果

3.1 腎臟組織的病理變化情況 通過系膜基質指數和腎臟小管間質指數（表1）評價組織纖維化的程度。模型組的系膜基質指數及腎小管-間質指數明顯高于假手術組（p< 0.05）；芪歸益腎組與洛丁新組均不同程度的使系膜基質的增生程度有一定的減輕，與模型組比較，組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。實驗表明芪歸益腎組藥物可以減少UUO模型動物細胞外基質增加，延緩腎臟纖維化的速度，從而減少對腎小球濾過功能的影響，達到治療的目的。

表1　各組大鼠腎臟系膜基質指數及腎臟小管病變-間質指數比較（±s）

注：與假手術組比較，*p<0.05；與模型組比較，△p<0.05；與洛丁新組比較，▲p<0.05

組別　　動物數/只　　系膜基質指數（Ms/Gs）腎小管-間質指數假手術組6　0.267±0.046　3.19±0.73模型組　6　0.451±0.052*　8.85±0.71*洛丁新組　6　0.392±0.061△　6.67±0.69△芪歸益腎組　6　0.288±0.050△▲　5.06±0.86△▲

3.2 各組大鼠腎臟免疫組織化學觀察結果 通過對腎臟組織的免疫組化分析結果來看，TGF-β1、Smad3、FN、ILK 和GSK-3β在假手術組腎組織中表達水平較低。相比較而言，模型組腎臟組織的TGF-β1、Smad3和FN相對于假手術組明顯的顏色加深。同時，ILK和GSK-3β染色的表達具有相似的變化，提示它們之間具有較為一致的相關性。洛丁新組和芪歸益腎組的上述指標染色強度較模型組比較均有不同程度的減輕，組間比較有統(tǒng)計學意義（p<0.05），且芪歸益腎組減輕程度優(yōu)于洛丁新組（p<0.05，表2）。結果顯示，芪歸益腎方劑抑制TGF-β/Smads/ILK/GSK-3細胞信號通路，調控ECM聚集的作用優(yōu)于洛丁新的療效，見圖1～5。

表2　各組大鼠光密度積分結果（±s）

表2　各組大鼠光密度積分結果（±s）

注：與假手術組比較，*p<0.05；與模型組比較，△p<0.05；與洛丁新組比較，▲p<0.05

組別　　動物數/只　TGF-β1　Smad3　FN　ILK　GSK-3β假手術組6　0.285±0.066　0.296±0.064　0.298±0.071　 0.233±0.051　 0.256±0.036模型組　6　0.487±0.052*　0.489±0.052*　0.478±0.062*　0.367±0.041*　0.354±0.045*洛丁新組　6　0.371±0.060△　0.381±0.069△　0.377±0.054△　0.311±0.039△　0.315±0.032△芪歸益腎組　6　0.325±0.053△▲　0.309±0.066△▲　0.303±0.044△▲　0.268±0.032△▲　0.278±0.042△▲

3.3 腎臟組織分子生物學的檢測分析 模型組TGF-β1、FN、ILK和GSK-3β的蛋白和基因表達與假手術組比較均明顯升高（p<0.05），應用芪歸益腎方劑與洛丁新干預后，其可以部分下調其表達量，且芪歸益腎組治療優(yōu)于洛丁新組。組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。以TGF-β1和FN為因變量，其他指標為自變量，進一步通過對數據的相關性分析表明，ILK和GSK-3β蛋白表達與纖維化相關的細胞因子TGF-β1之間顯著相關（r=0.756 4，p<0.05；r=0.721 9，p<0.05），見表3～4。

圖1　各組大鼠腎組織TGF-β1免疫組織化學圖片（DAB染色，×400）

圖2　各組大鼠腎組織Smad3免疫組織化學圖片（DAB染色，×400）

圖3　各組大鼠腎組織FN免疫組織化學圖片（DAB染色，×400）

圖4　各組大鼠腎組織ILK免疫組織化學圖片（DAB染色，×400）

圖5　各組大鼠腎組織GSK-3β免疫組織化學圖片（DAB染色，×400）

表3　各組腎臟組織RT-PCR檢測結果（±s）

表3　各組腎臟組織RT-PCR檢測結果（±s）

注：與假手術組比較，*p<0.05；與模型組比較，△p<0.05；與洛丁新組比較，▲p<0.05

GaPdh假手術組組別 　動物數/只　Tgfb1/GaPdh　Fn/GaPdh　IlK/GaPdh　GsK3b/ 0.301±0.018　0.292±0.021　0.338±0.045　0.331±0.052模型組　6　0.455±0.021*　0.435±0.025*　0.498±0.036*　0.477±0.041*洛丁新組　6　0.383±0.026△　0.382±0.025△　0.406±0.033△　0.357±0.039△芪歸益腎組　6　0.311±0.022△▲　0.303±0.019△▲　0.385±0.057△▲　0.301±0.042 6△▲

表4　各組腎臟組織W estern blot檢測結果（±s）

表4　各組腎臟組織W estern blot檢測結果（±s）

注：與假手術組比較，*p<0.05；與模型組比較，△p<0.05；與洛丁新組比較，▲p<0.05

/GAPDH假手術組組別 　動物數/只　TGF-β1/GAPDH　FN/GAPDH　ILK/GAPDH　GSK-3β 0.335±0.041　0.302±0.038　0.278±0.035　0.331±0.054模型組　6　0.556±0.035*　0.488±0.041*　0.475±0.031*　0.514±0.047*洛丁新組　6　0.441±0.032△　0.395±0.035△　0.366±0.037△　0.472±0.057△芪歸益腎組　6　0.399±0.038△▲　0.367±0.042△▲　0.335±0.032△▲　0.421±0.034 6△▲

4 討論

腎臟纖維化以腎小管間質腎纖維化為主，而腎小管上皮細胞向間充質細胞轉分化（EMT）是腎小管間質纖維化的核心機制［5-7］。TGF-β1是一個多功能的細胞因子，可以誘導腎臟上皮細胞向α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的肌成纖維細胞轉分化，使得ECM表達分泌能力增強［8］。ECM的代謝與基質金屬蛋白酶（MMPs）及其特異性抑制物（TIMPs）之間有著密切的關系。TGF-β1可以減少MMP生成及增加TIMP合成而抑制ECM降解，所以TGF-β1是一種強致纖維化因子。因此，TGF-β1在組織中表達水平在一定的程度上就決定了組織纖維化的程度。

整合素連接激酶（integrin-link kinase，ILK）是在哺乳動物上皮細胞的溶解物之中發(fā)現的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它參與了包括TGF-β1和Wnt在內的細胞信號傳導通路。GSK-3是糖原合成中的5個限速酶之一。人的GSK由兩個獨立基因編碼，其編碼產物分別被命名為GSK-3α 和GSK-3β，其分子量分別為51 kD和47 kD。其中，GSK-3β是一種高度保守的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶。通過ILK的調控作用其在蛋白合成、細胞增殖、細胞分化和細胞運動等諸多方面的作用，這些作用在腎臟病的發(fā)生、發(fā)展中常常有著重要的作用［9］。EMT在腎間質纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視。EMT發(fā)生時細胞表型發(fā)生改變并向肌成纖維細胞轉變，分泌并聚集細胞外基質而導致腎間質纖維化發(fā)生。GSK-3β在細胞內通常呈活性狀態(tài)，通過磷酸化下游底物而發(fā)揮生物學作用。在受到外界刺激后GSK-3β的N端絲氨酸殘基磷酸化形成假底物覆蓋活化位點而使該酶活性降低，從而改變其下游成份的活性或功能。研究表明ILK和GSK-3β是處于TGF-β/Smads下游的重要效應物［10］。

病理條件下，EMT在腎小管間質纖維形成中起著至關重要的作用。Li等的研究首次證實了ILK在TGF-β1介導的腎小管EMT中扮演著重要的角色。TGF-β1以時間和劑量依賴方式誘導ILK在腎小管上皮細胞表達，這種作用依賴于Smad信號。ILK在腎小管上皮細胞強有力的表達減弱了間質E-cadherin的表達，誘導了FN在細胞外的聚集［11］。ILK處于TGF-β1/Smad的下游，是EMT至關重要的效應物，ILK因其在TGF-β1/Smad信號通路中的重要作用而與EMT密切相關。許多證據表明ILK參與了EMT的發(fā)生。（1）TGF-β1通過完整的Smad信號途徑誘導內源性ILK的表達增加；（2）過度表達的外源性ILK導致上皮細胞E-鈣粘蛋白的丟失及α-平滑肌肌動蛋白的表達：導致FN的表達和在細胞外積聚；引起MMP-2的表達和分泌增加，并增加細胞遷移和侵襲力。這一步實際上是TGF-β1誘導EMT發(fā)生的整個過程的主要步驟。ILK表達增加時上皮細胞能分泌FN，而且FN向細胞外的沉積增快；阻斷ILK的作用后，FN的分泌不增加［12-13］；（3）具有負性區(qū)域激酶失活形式的ILK的異位表達能大部分清除TGF-β1介導的EMT能阻滯TGF-β1介導EMT的發(fā)生［13］，表明ILK對TGF-β1發(fā)揮作用是必須的。因此，在TGF-β1、Smad、ILK和EMT之間存在著線性的關系。通過上述因素作用下調控GSK-3β在腎臟組織的表達水平從而影響腎臟纖維化病變的進程。

研究表明，通過調控腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的藥物可以減輕單側輸尿管梗阻小鼠腎小管上皮細胞轉分化程度［14］。本研究表明芪歸益腎方劑的調控作用優(yōu)于洛丁新的治療作用，其作用機制可能在于調控RAS系統(tǒng)，同時其調控GSK-3β和ILK的表達水平，減輕ECM的聚集從而發(fā)揮了腎臟保護作用。

芪歸益腎方劑源自課題組以往研究的方劑“加味當歸補血湯”化裁而來，這是由慢性腎臟病（CKD）發(fā)生的病因所決定的［15］。對于腎小管間質纖維化病變而言，腎臟病變過程中出現的病變的特點、中醫(yī)辨證及其與細胞信號通路之間的關系，進行了專門的論述［16］。結合上述認識，課題組制定了芪歸益腎方劑。該方劑之中，芡實、金櫻子益腎健脾是為君藥，黃芪、太子參、白術重在健脾，是為臣藥，當歸、川芎、牛膝活血通絡，白花蛇舌草清利下焦，蟬蛻搜風通絡共為佐藥，甘草調和諸藥、牛膝益腎通絡又引藥入腎經同為使藥，針對病變之所達到治療目的。

TGF-β1、Smad3、FN、ILK和GSK-3β均參與腎間質纖維化的進程且具有線性相關性，病變特點與相關研究具有一致性［4］。從本研究的結果表明，芪歸益腎方劑可以減輕腎臟系膜基質增生和腎小管間質的病變程度（表1）。模型組小鼠TGF-β1、Smad3、FN、ILK和GSK-3β表達水平增加明顯（圖1～5），上述因素通過應用芪歸益腎方劑和洛丁新藥物干預后，腎臟纖維化程度均具有不同程度的減輕，且芪歸益腎方劑治療后的減輕的程度優(yōu)于洛丁新組（圖1～5，表2）。進一步應用分子生物學的研究方法，從基因和蛋白水平證實，芪歸益腎方劑在延緩腎臟纖維化進展的治療機制與細胞因子和粘附因子的調控密切相關（表3～4）。通過本研究證實，芪歸益腎方劑具有下調TGF-β/ Smads/ILK/GSK-3β表達和減輕ECM增生的程度，從而具有延緩腎臟纖維化病變進展的作用。

本研究證實以“健脾益腎、活血通絡”為治療原則的中藥方劑“芪歸益腎方劑”可以下調UUO腎病小鼠組織中TGF-β/Smads/ILK/GSK-3β細胞信號通路的表達水平，減輕ECM增生的程度，減輕腎臟小管-間質損害，從而達到延緩腎臟纖維化病變的進程的作用。

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*通信作者：熊佩華（1957—），女，主任醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結合腎臟病的基礎與臨床。E-mail：weimg@sina.com

作者簡介：魏明剛（1975—），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為中西醫(yī)結合腎臟病的基礎與臨床

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81273723，81473633）；江蘇省中醫(yī)藥管理局資助項目（LZ13235）；江蘇省第二批老中醫(yī)藥專家學術經驗繼承工作資助項目（2014）

收稿日期：2015-03-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.037

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1136-05