王　新， 唐　麗， 楊造鵬， 王　暉*

（1.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京102206；3.北京大學(xué)，北京100871）

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小檗堿對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠發(fā)揮保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)觀察

王新1， 唐麗2 *， 楊造鵬2，3， 王暉1*

（1.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京102206；3.北京大學(xué)，北京100871）

摘要：目的 探索小檗堿在葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用，為小檗堿更好的應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。方法 建立DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的模型，觀察給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組、未給藥小檗堿的對(duì)照組以及不做任何處理的正常飼喂飲用水的陰性對(duì)照組在個(gè)體、組織、細(xì)胞和分子水平的差異。結(jié)果 給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組小鼠腸炎表型得到恢復(fù)、組織損傷程度減輕、炎性細(xì)胞比例降低、促炎因子表達(dá)降低、促修復(fù)因子表達(dá)增多。結(jié)論 小檗堿可以減緩DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的發(fā)生，其機(jī)制可能是小檗堿通過(guò)抑制腸道外來(lái)細(xì)菌感染、抑制中性粒細(xì)胞的遷移和聚集、促進(jìn)修復(fù)因子的表達(dá)，從而使結(jié)腸炎得到恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：小檗堿；葡聚糖硫酸鈉；結(jié)腸炎

小檗堿（berberine）又稱(chēng)黃連素，是一種常見(jiàn)的異喹啉生物堿［1］，它存在于小檗科等4個(gè)科10個(gè)屬的許多植物中，傳統(tǒng)的作用是清濕熱、瀉火毒，后來(lái)發(fā)現(xiàn)小檗堿有治療糖尿病和抗腫瘤作用，對(duì)心血管和消化系統(tǒng)也有保護(hù)作用［2］。本研究主要探討小檗堿在抵抗結(jié)腸炎方面發(fā)揮的作用及其作用機(jī)制，以期為小檗堿治療結(jié)腸炎的臨床應(yīng)用提供更多依據(jù)。

結(jié)腸炎屬于自身免疫性疾病，是由病原體感染、遺傳、精神因素等引起的結(jié)腸炎癥性病變。我們采用葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，來(lái)研究小檗堿在結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用。

1 材料

1.1 儀器 流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司）；細(xì)胞超凈臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)公司），低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技）；立式壓力滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；-80℃超低溫冰箱（日本三洋電器集團(tuán)）；qPCR儀（美國(guó)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）；PCR儀；恒溫水浴振蕩器；分析天平；pH計(jì)；磁力攪拌器；離心管；研缽；解剖器材；針筒式濾頭；篩網(wǎng)；凍存管；灌胃針；注射器；移液槍?zhuān)粯岊^。

1.2 試藥 小檗堿（berberine，上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)130526）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，美國(guó)MP生物醫(yī)學(xué)有限公司，批號(hào)160110）；膠原酶IV（美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)015M4078V）；DNA酶（美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)SLBF7798V），分散酶（瑞士羅氏制藥有限公司，批號(hào)10887800）；Hank's平衡鹽溶液；蛋白胨；酵母提取物；瓊脂；國(guó)產(chǎn)血清；RPMI-1640培養(yǎng)基；PBS；異丙醇；三氯甲烷；Trizol（美國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)BCBL732V）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院27號(hào)院動(dòng)物房，SPF級(jí)，雄性，批號(hào)SCKX-［軍］2014-0002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 建立腸炎動(dòng)物模型 在SPF級(jí)動(dòng)物房將24只8周齡雄性小鼠隨機(jī)分為4組，陰性對(duì)照組、模型組、高劑量給藥組、中劑量給藥組。陰性對(duì)照組正常飼喂飲用水，不做其他處理；模型組用2.0％DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎5 d后換成正常飲用水；高劑量給藥組在誘導(dǎo)結(jié)腸炎5 d后連續(xù)3 d給藥小檗堿100 mg/kg［3］；低劑量給藥組在誘導(dǎo)結(jié)腸炎5 d后連續(xù)3 d給藥小檗堿50 mg/kg。每天對(duì)小鼠進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)并對(duì)其便血、便溏、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI，體質(zhì)量損失、便溏以及便血評(píng)分總和的平均值）情況打分［4］評(píng)價(jià)。

對(duì)比四組小鼠腸炎表型發(fā)現(xiàn)：第10天，中、高劑量給藥組比模型組的小鼠體質(zhì)量下降趨勢(shì)減緩（p<0.05）、便溏癥狀減輕（p<0.01）、便血程度得到緩解（p<0.01），DAI值降低（p<0.01）。因此我們可以判斷小檗堿對(duì)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的表型恢復(fù)確實(shí)發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖1。

2.2 腸道菌落數(shù)量（CFUS）檢測(cè) 用蛋白胨、酵母提取物、瓊脂來(lái)配制無(wú)抗LB培養(yǎng)基，高壓滅菌后待不燙手時(shí)在細(xì)菌超凈臺(tái)中鋪板。取3組小鼠第10天的糞便用無(wú)菌PBS溶解成3個(gè)質(zhì)量濃度梯度（10、1、0.1 mg/mL），每個(gè)梯度涂3個(gè)板子，每個(gè)板子涂板600 μL糞便菌液，37℃烘箱過(guò)夜培養(yǎng)，第2天觀察并計(jì)數(shù)菌落數(shù)量［5］。

注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01圖1　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠的表型影響

對(duì)比3組（未做中劑量小檗堿給藥組）小鼠糞便菌落數(shù)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組菌落數(shù)很少，僅為104個(gè)數(shù)量級(jí)；給藥小檗堿后的小鼠糞便中菌落數(shù)明顯減少（p<0.01），可以判斷小檗堿在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中發(fā)揮天然植物抗生素的作用，抑制損傷后腸道菌群的繁殖［6］，從而發(fā)揮保護(hù)功能。見(jiàn)圖2。

注：與模型組比較，**p<0.01圖2　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠糞便菌落數(shù)的影響

2.3 結(jié)腸形態(tài)觀察 第10天，分別取4組小鼠結(jié)腸，量取結(jié)腸長(zhǎng)度并拍照記錄。

對(duì)比觀察3組小鼠之間結(jié)腸形態(tài)的差異發(fā)現(xiàn)，第10天，模型組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度變粗變短；中、高劑量給藥組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度已經(jīng)恢復(fù)正常形態(tài)，與陰性對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）?？梢?jiàn)，小檗堿在DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎中對(duì)結(jié)腸形態(tài)的恢復(fù)具有重要作用。見(jiàn)圖3。

注：與模型組比較，*p<0.05圖3　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸形態(tài)的影響

2.4 組織切片HE染色觀察 分別取4組小鼠第10天的結(jié)腸組織于Hank's平衡鹽溶液（HBSS）中清洗除去糞便，在10％中性福爾馬林中盤(pán)旋固定超過(guò)24 h，之后在清華病理切片室做石蠟切片和HE染色，200倍和400倍熒光顯微鏡下用白光觀察和拍照。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組結(jié)腸組織形態(tài)完好，結(jié)構(gòu)分層明顯，無(wú)損傷，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)；模型組小鼠結(jié)腸組織損傷嚴(yán)重，黏膜層基本結(jié)構(gòu)遭到破壞，杯狀細(xì)胞大量缺失，固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏膜肌層可見(jiàn)組織水腫和充血；中、高劑量給藥組小鼠結(jié)腸組織損傷程度減輕，組織結(jié)構(gòu)層次分明，固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，杯狀細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，黏膜肌層未見(jiàn)組織水腫和充血，組織形態(tài)已明顯恢復(fù)。見(jiàn)圖4。

2.5 分離結(jié)腸固有層單核細(xì)胞（LPMC）并用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)炎性細(xì)胞比例

2.5.1 分離LPMC 分別取3組（不包括高劑量給藥組）小鼠第10天的結(jié)腸組織，剪成1～2 cm長(zhǎng)的片段，然后預(yù)消化處理20 min除去腸上皮細(xì)胞，再經(jīng)膠原酶IV、分散酶口、DNA酶 消化處理30 min除去細(xì)胞黏連，得到的細(xì)胞過(guò)70 μm篩網(wǎng)后密度梯度離心處理30 min，即得到LPMC。之后標(biāo)記兩組流式抗體（Ly6c-PEcy7和CD11b-APC、Gr-1-FITC和CD11b-APC），避光冰上放置30 min，再用含3％血清的1640培養(yǎng)基洗掉抗體，最后用2％多聚甲醛固定，暫時(shí)放4℃冰箱避光保存。

圖4　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

2.5.2 流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)炎性細(xì)胞比例 將固定好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式上樣管中，開(kāi)機(jī)并啟動(dòng)分析軟件，調(diào)試細(xì)胞分群，待收集到1×105個(gè)細(xì)胞時(shí)，停止檢測(cè)，獲取數(shù)據(jù)。

結(jié)果可以看到，在單核細(xì)胞比例方面，中劑量給藥組和模型組小鼠結(jié)腸無(wú)明顯差異；在中性粒細(xì)胞方面，中劑量給藥組比模型組比例明顯降低，推測(cè)小檗堿抑制結(jié)腸炎的主要機(jī)制可能是通過(guò)抑制了中性粒細(xì)胞遷移和聚集［7］來(lái)實(shí)現(xiàn)的。見(jiàn)圖5。

圖5　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠炎性細(xì)胞比例的影響

2.6 提取組織RNA并qPCR檢測(cè)炎性因子含有量

2.6.1 RNA的提取 分別取3組（不包括高劑量給藥組）小鼠第10天的結(jié)腸組織，只取小部分即可，將組織于液氮中研磨至粉末，然后再超凈臺(tái)中加入TRIzol和氯仿，分層取水相，加入等體積異丙醇離心得到RNA沉淀，75％乙醇洗沉淀，最后用無(wú)RNA酶的水溶解沉淀即得RNA［8］，-80℃保存。提取的RNA經(jīng)DNA酶消化去除DNA后，70℃金屬浴處理10 min，之后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒，準(zhǔn)備20 μL反應(yīng)體系，PCR中進(jìn)行反應(yīng)得cDNA。

2.6.2 qPCR 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后進(jìn)行qPCR，用IQ5軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥小檗堿的實(shí)驗(yàn)組促修復(fù)因子Tgfb表達(dá)升高［9］，而促炎因子Tnfa、Il23表達(dá)降低。見(jiàn)圖6。

3 結(jié)論

腸道是體內(nèi)最大的免疫器官，全身約70％的免疫細(xì)胞存在于腸道［10］，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的第一道防線(xiàn)。當(dāng)用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎時(shí)，DSS因帶有負(fù)電荷的硫酸基而對(duì)結(jié)腸上皮有毒性并誘導(dǎo)其糜爛從而損害結(jié)腸屏障完整性和增加結(jié)腸上皮滲透性［11］，進(jìn)而破壞機(jī)體的第一道防線(xiàn)，外界的病菌就會(huì)通過(guò)破損的屏障進(jìn)入腸道，此時(shí)中性粒細(xì)胞作為機(jī)體免疫的一線(xiàn)細(xì)胞就會(huì)遷移到損傷部位，中性粒細(xì)胞上的NF-κβ信號(hào)被激活［12］從而釋放TNF-α等炎性因子而引起炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為小鼠體質(zhì)量下降、結(jié)腸變粗變短、炎性細(xì)胞比例增加、組織結(jié)構(gòu)破會(huì)嚴(yán)重等。

當(dāng)給藥小檗堿后，小檗堿一方面作為天然的廣譜抗生素能夠抑制菌群繁殖，減少外來(lái)病菌入侵，從而抵抗腸道感染［13］，另一方面小檗堿可以通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞NF-κβ活性［14］，改變中性粒細(xì)胞遷移，減少炎性部位中性粒細(xì)胞的聚集進(jìn)而降低促炎性因子TNF-α、IL-23的分泌從而抑制腸炎的發(fā)生，最后小檗堿通過(guò)促進(jìn)促修復(fù)因子TGF-β的表達(dá)，使損傷的屏障得到恢復(fù)。這樣小檗堿通過(guò)其內(nèi)外兼治的作用在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中發(fā)揮著保護(hù)作用，最終使結(jié)腸炎得以治愈。

注：高劑量給藥組與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01圖6　小檗堿對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織炎性因子的影響

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*通信作者：唐 麗（1977—），女，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事肝臟免疫研究。Tel：（010）61777091，E-mail：tangli731@163.com 王 暉（1964—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥皮膚藥理研究。Tel：（020）39352880，E-mail：gdwanghui2006@ 126.com

作者簡(jiǎn)介：王 新（1989—），女，碩士生，從事中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究。E-mail：xinjielian55@126.com

收稿日期：2015-11-02

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.035

中圖分類(lèi)號(hào)：R966

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1132-04