謝 苗， 楊　淋， 楊曉珍， 周　平， 藍(lán)　海

（大理大學(xué)，云南大理671000）

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HPLC法同時(shí)測定紫地榆3種提取物中4種成分

謝 苗， 楊淋， 楊曉珍， 周平， 藍(lán)海*

（大理大學(xué)，云南大理671000）

摘要：目的 建立HPLC法同時(shí)測定紫地榆Geranium strictiPes R.Kunth乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸的含有量。方法 提取物分析采用Thermo Syncronis AQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5％磷酸水溶液（B），梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長214 nm（沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素）、254 nm（鞣花酸）。結(jié)果 沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸在0.106～2.64 μg（r=0.999 8）、0.106～1.59 μg（r=0.999 7）、0.024～0.288 μg（r=0.999 6）、0.252～6.30 μg（r= 0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。沒食子酸、鞣花酸含有量分別在水、乙酸乙酯提取物中最高，而正丁醇及水提取物中均未檢測到?jīng)]食子酸甲酯和兒茶素。結(jié)論 該方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于紫地榆的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：紫地榆；提取物；沒食子酸；沒食子酸甲酯；兒茶素；鞣花酸；HPLC

紫地榆Geranium strictiPes R.Kunth是牻牛兒苗科老鸛草屬植物，為中國特有植物，主要生長于云南、四川等地，是白族常用的民族藥，根部是其主要藥用部位。其具有清熱利濕，活血止血功效，可用于治療腸炎、痢疾、消化不良、慢性胃炎等疾病。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，紫地榆具有抑菌防齲［1］功效和抗艾滋病病毒活性［2］。本課題組前期分別研究了乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的抑菌活性［3］以及抵抗齲病的作用，但目前其成分含有量測定的報(bào)道比較少見［4］，本實(shí)驗(yàn)對這3種提取物［5］中沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸的含有量進(jìn)行測定，旨在為紫地榆萃取物抗菌活性的研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀；SB2200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AE240電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KL-UP-UV-20超純水儀（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.1.2 藥材和對照品 紫地榆購自大理市藥材市場，經(jīng)大理學(xué)院生藥學(xué)教研室楊月娥老師鑒定為紫地榆Geranium strictiPes R.Kunth的根。沒食子酸（批號110831-201204）和兒茶素對照品（批號110877-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院；鞣花酸對照品（批號MUST-12110903）購自成都曼思特生物科技有限公司；沒食子酸甲酯對照品（批號MKBS9783V）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 試劑 甲醇和乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

1.2 色譜條件 Thermo Syncronis AQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5％磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min， 5％→12％A；10～25 min，12％A；25～50 min，12％→18％A；50～60 min，18％→20％A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長214 nm（沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素）、254 nm（鞣花酸）［6-7］；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸對照品21.1、10.6、3.2、4.0 mg，置于2 mL量瓶中，甲醇（鞣花酸用水）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得相應(yīng)的貯備液。精密吸取貯備液適量，置于2 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，搖勻，制成分別含4種成分105.5、106、16、200 μg/mL的混合對照品溶液。

1.4 供試品溶液的制備 精密稱取紫地榆乙酸乙酯、正丁醇和水提取物浸膏0.06、0.01、0.01 g，置于2 mL量瓶中，精密加入60％甲醇至刻度，密塞，稱重，超聲處理10 min，冷卻，60％甲醇補(bǔ)足減失的重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2 結(jié)果和方法學(xué)考察

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在“1.2”項(xiàng)色譜條件下依次進(jìn)樣供試品及對照品溶液，發(fā)現(xiàn)色譜圖中沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸與其他組分均達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，而且其對應(yīng)的位置無干擾［8-9］。具體見圖1。

2.2 線性關(guān)系考察 取“1.3”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，進(jìn)樣1、2、5、10、15、20 μL分析，記錄色譜峰面積。以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），相應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，可知4種成分均呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 在“1.2”項(xiàng)色譜條件下，將“1.3”項(xiàng)下混合對照品溶液進(jìn)樣6次，每次10 μL，測得沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素［10］和鞣花酸的峰面積RSD分別為0.85％、0.87％、0.87％和0.92％，表明儀器精密度良好。

1.沒食子酸 2.沒食子酸甲酯 3.兒茶素 4.鞣花酸1.gallic acid 2.methyl gallate 3.catechin 4.ellagic acid圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

表1　4種成分的回歸方程Tab.1 Regression equations of four constituents

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批紫地榆粉末適量，先在相同條件下提取乙醇浸膏，再分別萃取乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，按“1.4”項(xiàng)下方法將其各平行制備6份，最后在“1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取紫地榆乙酸乙酯、正丁醇和水提取物適量，按“1.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2　重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of reproducibility and stability tests（n=6）

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱定3個(gè)部位含有量已知的同一批樣品6份，其中乙酸乙酯提取物約30.5 mg，正丁醇提取物約60.0 mg，水提取物約40.0 mg，置于量瓶中，分別精密加入相應(yīng)的對照品溶液，60％甲醇定容至10 mL，按照“1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“1.2”項(xiàng)色譜條件下測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3～5。

表3　乙酸乙酯提取物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for ethyl acetate extract （n=6）

表4　正丁醇提取物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for n-butyl alcohol extract （n=6）

表5　水提物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.5 Resu lts of recovery tests for water extract（n=6）

2.7 含有量測定 精密稱取3批紫地榆乙酸乙酯、正丁醇和水提取物，每批3份，置于量瓶中，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下計(jì)算含有量，結(jié)果見表6。

表6　含有量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.6 Determ ination results of contents（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 4種成分的對照品溶液分別進(jìn)樣經(jīng)二極管陣列檢測器［11］（DAD）檢測，所得圖譜（190～400 nm）以及3D圖譜顯示，沒食子酸甲酯、兒茶素在207 nm處有最大吸收，而鞣花酸在260 nm處左右。為準(zhǔn)確反映各成分含有量，本實(shí)驗(yàn)利用Aglient1200色譜儀的波長切換功能來選擇各成分最大吸收波長，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)干擾更少。

3.2 流動(dòng)相的選擇 HPLC法采用的流動(dòng)相［12-13］大多為甲醇-水、甲醇-酸水、乙腈-水、乙腈-酸水溶液等。參考相關(guān)文獻(xiàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾采用甲醇-水、甲醇-0.2％乙酸、甲醇-0.1％磷酸、乙腈-0.1％磷酸和乙腈-0.05％磷酸水溶液等，最終選擇乙腈-0.5％磷酸水溶液作為流動(dòng)相，所得色譜圖峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度高。

3.3 柱溫和流速的選擇 沒食子酸甲酯和兒茶素對照品的極性相近，為了達(dá)到滿意的分離效果，本實(shí)驗(yàn)分別考察了在柱溫為20、25、30和40℃，以及體積流量為0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mL/min時(shí)對分離度的影響。結(jié)果表明，隨著溫度升高，分離度增加；隨著體積流量增大，分離度降低。綜合考慮，在體積流量為1.0 mL/min、溫度為25℃的條件下，可使沒食子酸甲酯和兒茶素完全分離。

3.4 小結(jié) 目前，有關(guān)紫地榆的質(zhì)量研究僅涉及到?jīng)]食子酸含有量［14］，難以全面反映其質(zhì)量情況。作為紫地榆藥理活性研究課題［15］的重要部分，本實(shí)驗(yàn)通過測定其中沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素和鞣花酸在乙酸乙酯、正丁醇和水提取物中的含有量，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物中4種成分的含有量均較高，并以鞣花酸為最高；水提取物中，沒食子酸含有量最高，但正丁醇及水提取物中均未檢測到?jīng)]食子酸甲酯和兒茶素。本實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法簡單、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，對紫地榆的質(zhì)量控制和臨床安全用藥具有積極意義。

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Simultaneous determ ination of four constituents in three extracts of Geranium strictiPes by HPLC

XIE Miao， YANG Lin， YANG Xiao-zhen， ZHOU Ping， LAN Hai*
（Dali University，Dali671000，China）

ABSTRACT：AIM To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of gallic acid，methyl gallate，catechin and ellagic acid in ethyl acetate，n-butanol and water extracts of Geranium strictiPesbook=1067,ebook=113R.Kunth.METHODS The analyses of extracts were performed on a Thermo Syncronis AQ C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobile phasewas acetonitrile（A）-0.5％phosphoric acid solution（B）with gradient elution，flow rate was 1.0 mL/min，column temperature wasmaintained at25℃，and detection wavelengths were set at214 nm for gallic acid，methyl gallate and catechin，and 254 nm for ellagic acid.RESULTS Gallic acid，methyl gallate，catechin and ellagic acid showed good linear relationships within the ranges of 0.106 -2.64 μg （r=0.999 8），0.106 -1.59 μg（r=0.999 7），0.024 -0.288 μg（r=0.999 6）and 0.252 -6.30 μg（r= 0.999 9）.The contents of gallic acid and ellagic acid were the highest in water and ethyl acetate extracts，respectively.Methyl gallate and catechin were not detected in n-butanol and water extracts.CONCLUSION This method is simple and accurate with good reproducibility，which can be used for the quality control of G.strictiPes.

KEYWORDS：Geranium strictiPes R.Kunth；extracts；gallic acid；methyl gallate；catechin；ellagic acid；HPLC

*通信作者：藍(lán) 海，女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事天然藥物防齲研究。Tel：13769225179，E-mail：lanhai8696@126.com

作者簡介：謝 苗（1989—），女，碩士生，從事天然藥物防齲研究。Tel：18313001720，E-mail：704160547@qq.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81260512）；云南省大理學(xué)院應(yīng)用開發(fā)研究基金（Kyyy201102）

收稿日期：2015-10-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.021

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1066-05