霍江燕， 吳桂芳， 馮素香， 牛德興， 梁生旺*

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008；3.鄭州德興皰疹疾病研究所，河南鄭州450008）

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HPLC法測定皰疹康噴霧劑中6種成分

霍江燕1， 吳桂芳1， 馮素香2， 牛德興3， 梁生旺1*

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008；3.鄭州德興皰疹疾病研究所，河南鄭州450008）

摘要：目的 建立HPLC法測定皰疹康噴霧劑（大黃、黃連、白芷等）中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿的含有量。方法 鹽酸小檗堿的分析采用Venusil XBP C18（L）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸-三乙胺（28∶70∶1∶1）；檢測波長265 nm；柱溫25℃；體積流量1 mL/min。其他5種成分的分析采用Venusil XBPC18（L）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1％磷酸溶液（75∶25）；檢測波長254 nm；柱溫25℃；體積流量1 mL/min。結(jié)果 蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、鹽酸小檗堿分別在0.017 9～0.358 μg（r=0.999 9）、0.018 2～0.364 μg（r=0.999 8）、0.018 9～0.338 μg（r=0.999 9）、0.008 0～0.160 μg（r=1）、0.008 9～0.177 μg（r=0.999 9）、0.147～1.470 μg（r=0.999 7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為101.3％（RSD=1.0％）、102.8％（RSD=1.5％）、101.2％（RSD=1.9％）、102.7％（RSD= 1.3％）、100.2％（RSD=1.9％）、101.3％（RSD=2.0％）。結(jié)論 該方法靈敏、簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于皰疹康噴霧劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：皰疹康噴霧劑；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；鹽酸小檗堿；HPLC

皰疹康噴霧劑處方源于臨床經(jīng)驗(yàn)方，由大黃、黃連、白芷、五倍子等11味中藥組成，系直接外用皮膚給藥，具有抗水痘（帶狀皰疹病毒）［1］作用，能促進(jìn)帶狀皰疹、褥瘡和濕疹康復(fù)，并緩解由此引起的神經(jīng)痛，療效明顯，副作用少［2］。本品制成外用噴霧劑時(shí)，具有使用方便、有利于藥物均勻分散于患處、皮膚易于吸收、作用迅速等優(yōu)點(diǎn)，是治療帶狀皰疹較為理想的藥物。

其中，大黃［3-4］抗菌、抗病毒活性較強(qiáng)，能促使人體產(chǎn)生干擾素，具有免疫調(diào)節(jié)、增強(qiáng)抵抗力、抗衰老作用，是治療熱毒瘡瘍的佳品；黃連［5］具有抗菌及抗病毒活性，其抗菌譜廣泛，而且對很多病毒也具有抑制作用，與大黃相須為用，能增強(qiáng)降火瀉熱，涼血解毒之功效［6］；白芷［7］具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤活性；五倍子［8］具有抗菌、抗病毒活性，能清除自由基，從而產(chǎn)生抗氧化作用，其所含的沒食子酸對蛋白質(zhì)有沉淀作用，可使皮膚、黏膜潰瘍面的組織蛋白凝固，形成一層被膜而呈收斂功效，同時(shí)還可收縮小血管而止血；冰片［9］有抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦以及雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)作用，還能提高其他藥物的生物利用度；升麻［10］含有多種活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抑制核苷運(yùn)轉(zhuǎn)、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能、消炎、抗骨質(zhì)疏松等作用。為有效控制該制劑的質(zhì)量，確保臨床用藥的有效性和安全性，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對制劑中大黃的有效成分大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和黃連的有效成分鹽酸小檗堿進(jìn)行含有量測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；MS105DU電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；HH-S2s數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）。

1.2 材料 大黃、黃連、白芷、五倍子等藥材購自鄭州德興保健品公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定，均符合《中國藥典》2010年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110713-201212、110795-201007、110757-200206、110756-200110、110796-201118，110758-201114）。實(shí)驗(yàn)樣品（自制）。甲醇、乙腈為色譜純（美國天地公司）；其他試劑均為分析純；液相用水為超純水；水為雙蒸水（自制）。

2 含有量測定［11］

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚的分析采用Venusil XBP C18（L）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1％磷酸溶液（75∶25）；檢測波長254 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min；理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算，應(yīng)不低于3 000。黃連分析采用博納艾杰爾XBP C18（L）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水-冰乙酸-三乙胺（28∶70∶1∶1）；檢測波長265 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1 mL/min；理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于5 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，甲醇溶解，制成含蘆薈大黃素（91.2 μg/mL）、大黃酸（86 μg/mL）、大黃素（82.8 μg/mL）、大黃酚（40.2 μg/mL）、大黃素甲醚（44.4 μg/mL）的貯備液。分別精密吸取2 mL，混勻，即得（每1 mL溶液中含蘆薈大黃素17.88 μg、大黃酸18.2 μg、大黃素18.88 μg、大黃酚8.00 μg、大黃素甲醚8.86 μg）。再精密稱取鹽酸小檗堿對照品適量，同法制成73.48 mg/L的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 大黃供試品溶液的制備方法參考《中國藥典》2010年版，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察鹽酸體積分?jǐn)?shù)（A）、回流時(shí)間（B）、萃取溶劑（C）對樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚總含有量的影響，以優(yōu)選出最佳條件。因素水平見表1。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，精密吸取樣品（本實(shí)驗(yàn)所用樣品為預(yù)實(shí)驗(yàn)樣品，僅濃縮后合并，故含有量高于小試樣品）5 mL，按一定鹽酸體積分?jǐn)?shù)回流一定時(shí)間，用不同溶液萃取后，蒸干萃取液，甲醇定容至25 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，得1～9號供試品溶液。在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定5個(gè)成分的總含有量。結(jié)果見表2和表3。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal tests

表3　方差分析Tab.3 Analysis of variance

由直觀分析結(jié)果可知，各因素影響5個(gè)成分總含有量的順序依次為C>B>A。方差分析結(jié)果表明，因素C影響最顯著，根據(jù)極差分析結(jié)果，C取C3；因素A和B均無顯著性差異，根據(jù)極差分析結(jié)果，A取A3，C取C3。因此，最佳條件為A3B3C3，具體如下。

精密吸取本品5 mL，置水浴上蒸干，加10％鹽酸30 mL，超聲處理2 min，再加乙酸乙酯20 mL，加熱回流75 min，放冷，置于分液漏斗中，40 mL乙酸乙酯洗滌容器，并入分液漏斗中，分取乙酸乙酯層，酸液再用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共4份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得5個(gè)成分的平均總含有量為1.72％，RSD值為0.53％，表明該方法穩(wěn)定可行。

鹽酸小檗堿供試品溶液的制備方法為精密吸取樣品10 mL，置于100 mL量瓶中，鹽酸∶甲醇（1∶100）溶液定容至刻度，混勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 制備缺大黃和黃連的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.3 專屬性考察 精密吸取對照品、供試品和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，發(fā)現(xiàn)陰性樣品在對照品溶液相同的保留時(shí)間處均無色譜峰，表明陰性無干擾，見圖1～2。

1.鹽酸小檗堿1.berberine hydrochloride圖1　鹽酸小檗堿HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of berberine hydrochloride

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取大黃中5個(gè)成分的混合對照品溶液1、2、6、10、14、16、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，以峰面積積分值（Y）對進(jìn)樣量（μg，X）回歸，得方程分別為蘆薈大黃素Y=5.860 6X+12.952（r=0.999 9），線性范圍0.017 9～0.358 0 μg；大黃酸Y=4.691 4X+ 11.835（r=0.999 8），線性范圍0.018 2～0.364 0 μg；大黃素Y=2.824 7X+7.420 6（r= 0.999 9），線性范圍0.018 9～0.338 0 μg；大黃酚Y=8.536 8X+4.557 0（r=1），線性范圍0.008 0～0.160 0 μg；大黃素甲醚Y=3.297 5X+1.528 3 （r=0.999 9），線性范圍為0.008 9～0.177 0 μg。

1.蘆薈大黃素 2.大黃酸 3.大黃素 4.大黃酚 5.大黃素甲醚1.aloe-emodin 2.rhein 3.emodin 4.chrysophanol 5.physcion圖2　5個(gè)成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of five constituents

精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液2、6、10、14、16、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，以峰面積積分值（Y）對進(jìn)樣量（μg，X）回歸，得方程Y=2 747.475 26X+26.217 031（r= 0.999 67），表明鹽酸小檗堿在0.147～1.470 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測定6次。結(jié)果，鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.12％、0.09％、0.11％、0.09％、0.11％、0.21％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批（批號140407）供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、6、8、10、12 h進(jìn)樣。結(jié)果，鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.59％、0.66％、0.45％、0.39％、0.38％、0.43％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察 取同一批次樣品，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果，鹽酸小檗堿、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD分別為0.24％、1.21％、1.94％、1.82％、1.61％、1.41％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率考察 分別精密稱取鹽酸小檗堿含有量已知的樣品5 mL，以及大黃中5個(gè)成分總含有量已知的樣品2.5 mL，各9份，精密加入相應(yīng)對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定，結(jié)果見表4～5。

表4　鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for berberine hydrochloride

2.9 樣品含有量測定 取3批樣品（批號140407、140408、140409），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及總平均含有量分別為0.01、0.04、0.05、0.08、0.02、0.21 mg/mL，RSD分別為1.51％、1.92％、1.72％、1.31％、1.21％、1.83％，鹽酸小檗堿平均含有量為0.78 mg/mL，RSD為0.82％。

3 討論

方中大黃的主要活性成分為蒽醌類衍生物，具有抗病原微生物及抗炎活性，對流感、風(fēng)疹、肝炎等病毒，以及幽門螺桿菌、白色念球菌、新生隱球菌、曲霉菌、青春型雙歧桿菌等細(xì)菌有明顯的抑制作用。另外，大黃素在體內(nèi)外也均具有顯著的抗單純皰疹病毒作用；方中黃連作為古老抗菌藥，抗菌譜廣泛，對很多病毒均有抑制作用［12］，其主要有效成分為小檗堿，具有較強(qiáng)的抑菌活性［13-14］。為更好控制皰疹康噴霧劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)測定大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，以及黃連中鹽酸小檗堿的含有量，具有一定的實(shí)際意義，該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

表5　5個(gè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests for five constituents

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察鹽酸溶液體積分?jǐn)?shù)、回流時(shí)間、萃取溶劑對大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚總含有量的影響，以優(yōu)選出最佳條件。然后，通過對柱溫、色譜柱、檢測波長、流動(dòng)相等因素進(jìn)行考察，確定色譜條件，其準(zhǔn)確、穩(wěn)定，故可用于皰疹康噴霧劑中有效成分含有量的測定。

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Determ ination of six constituents in PaozhenKang Spray by HPLC

HUO Jiang-yan1， WU Gui-fang1， FENG Su-xiang2， NIU De-xing3， LIANG Sheng-wang1*
（1.School of Traditional ChineseMedicine，Guangdong pharmaceutical University；Key Laboratory of Traditional ChineseMedicine Digitalization Quality Evaluation，State Administration of Traditional Chinese Medicine；Research Center for Traditional Chinese Medicine Quality Engineering Technology for Guangdong Universities，Guangzhou 510006，China；2.School of pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China；3.Zhengzhou Institute of Dexing HerPes Diseases，Zhengzhou 450008，China）

ABSTRACT：AIM To establish an HPLCmethod for determining the contents of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol，physcion and berberine hydrochloride in Paozhenkang Spray（Rheum Palmatum，CoPtis chinensis，Angelica dahurica，etc.）.METHODS The analysis of berberine hydrochloride was conducted on Venusil XBP C18（L）column（4.6 mm×250 mm，5 μm）with its temperature maintained at 25℃，a mobile phase of acetonitrile-water-acetic acid-triethylamine（28∶70∶1∶1），265 nm for detection wavelength，and flow rate of 1 mL/min.The analyses of another five constituents were performed on Venusil XBP C18（L）column（4.6 mm× 250 mm，5 μm）and amobile phase comprising ofmethanol-0.1％phosphoric acid solution in ratio 75∶25. The other conditionswere 254 nm detection for wavelength，25℃for column temperature，and 1 mL/min for flow rate.RESULTS Aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol，physcion and berberine hydrochloride showed good linear relationshipswithin the ranges of0.017 9 -0.358 μg（r=0.999 9），0.018 2 -0.364 μg（r=0.999 8），0.018 9 -0.338 μg（r=0.999 9），0.008 0 -0.160 μg（r=1），0.008 9 -0.177 μg（r=0.999 9）and 0.147 -1.470 μg（r=0.999 7），whose average recoveries were 101.3％，102.8％，101.2％，102.7％，book=1036,ebook=82100.2％and 101.3％with the RSDs of 1.0％，1.5％，1.9％，1.3％，1.9％and 2.0％，respectively. CONCLUSION This sensitive，accurate，simple and reproducible method qualifies in the quality control of Paozhenkang Spray.

KEY WORDS：Paozhenkang Spray；aloe-emodin；rhein；emodin；chrysophanol；physcion；berberine hydrochloride；HPLC

*通信作者：梁生旺（1954—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。Tel：（020）39352172，E-mail：swliang371@ 126.com

作者簡介：霍江燕（1992—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。Tel：18814099625，E-mail：cpu2009huojiangyan@163.com

收稿日期：2015-10-27

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.014

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1035-05