徐曉勇， 馬鳳森，*， 方劍喬， 梁　宜， 吳小娟

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310009）

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響應(yīng)面法優(yōu)選雷公藤超聲提取工藝

徐曉勇1， 馬鳳森1，2*， 方劍喬2， 梁宜2， 吳小娟1

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310009）

摘要：目的 優(yōu)化雷公藤TriPterygium wifordii Hook.f.的超聲提取工藝。方法 以總?cè)坪腿ゼ诐衫救橹笜?biāo)，以超聲功率、粉碎粒度、提取時(shí)間為影響因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化雷公藤的超聲提取工藝。結(jié)果 最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲功率400 W、粉碎粒度30目，提取時(shí)間40 min?？?cè)坪腿ゼ诐衫救┨崛÷史謩e為（1.282±0.025）％和（0.518±0.006）％。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單有效，具有實(shí)際意義。

關(guān)鍵詞：雷公藤；總?cè)?；去甲澤拉木醛；超聲提??；響?yīng)面法

雷公藤（TriPterygium wilfordii Hook.f.）為衛(wèi)矛科藤本植物，具有祛風(fēng)活絡(luò)，破淤止痛等功效?，F(xiàn)代研究表明，其有抗免疫、抗炎、抗生育及抗腫瘤等作用［1］，臨床常用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的治療［2-3］。

由于雷公藤毒性大，成分復(fù)雜，故藥材提取以單一成分為指標(biāo)時(shí)，難以保證其質(zhì)量。雷公藤全根中主要含生物堿、二萜、三萜、倍半萜及多糖［4］等成分，毒性大小依次為二萜、生物堿、三萜［5］。其中，雷公藤三萜類(lèi)成分已被證明具有明顯的藥理作用，而且雷公藤紅素、去甲澤拉木醛與二萜雷公藤甲素有著顯著的抗免疫活性［3-6］，但雷公藤紅素和雷公藤甲素存在毒副作用過(guò)大、致突變性較強(qiáng)的缺陷［7-8］，而去甲澤拉木醛的含有量高，毒性較小，其LD50值為1 295 mg/kg［9］。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究［10］的基礎(chǔ)上，選擇去甲澤拉木醛和總?cè)谱鳛槔坠偬崛」に嚨闹笜?biāo)，進(jìn)行多指標(biāo)的質(zhì)量控制。

首先，應(yīng)用單因素試驗(yàn)法考察了藥材產(chǎn)地、藥材部位、提取方法、提取溶劑、粉碎粒度、提取時(shí)間、料液比、提取功率、提取次數(shù)對(duì)雷公藤有效成分提取率的影響。結(jié)合文獻(xiàn)［11］與實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)結(jié)果影響較大的提取功率、粉碎粒度、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)。然后，采用Box-Benhnken法［12］對(duì)超聲提取［13］雷公藤全根藥材的最佳工藝條件進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀（515-717-486，美國(guó)Waters公司）；UV-1600PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；JY92-Ⅱ細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；PT-1004/205電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；FW177中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

雷公藤根采自浙江省景寧縣，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科專(zhuān)家鑒定為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤TriPterygium wilfordii Hook.f.的全根，批號(hào)為20130314。去甲澤拉木醛純品購(gòu)自南通飛宇生物技術(shù)有限公司，批號(hào)FY18540803，含有量99.35％。高效液相所用試劑為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 雷公藤有效成分的提取工藝 取干燥雷公藤全根，粉碎，精密稱(chēng)取藥材粉末10 g，加入10倍量乙酸乙酯，超聲提取一定時(shí)間，抽濾，棄去濾渣，測(cè)量并記錄濾液體積，即得藥材提取液。

2.2 去甲澤拉木醛的含有量測(cè)定

2.2.1 色譜條件［14］Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；流動(dòng)相乙腈-0.1％磷酸水溶液（55∶45）；柱溫室溫；體積流量1.0 mL/min。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取去甲澤拉木醛對(duì)照品適量，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含去甲澤拉木醛21.35 μg/mL的溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取雷公藤乙酸乙酯提取液適量，70℃下?lián)]干，甲醇溶解并定容至5 mL，過(guò)濾，即得。

2.2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品和供試品溶液適量，分別注入HPLC色譜儀中測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，可知供試品溶液中去甲澤拉木醛的分離度大于1.5。

1.去甲澤拉木醛1.demethylzeylasteral圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD為0.18％，表明儀器精密度良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 精密吸取6份等量雷公藤提取液（約含去甲澤拉木醛17 mg），稀釋后加入等量的對(duì)照品溶液，混合均勻，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得回收率為95.8％，RSD 為1.63％。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份雷公藤提取液適量，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)得RSD為1.55％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取不同體積的對(duì)照品溶液注入HPLC色譜儀，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程Y=1 200.9X-0.089 4，r=0.999 7，在0.1～1.3 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h注入液相色譜儀，測(cè)得RSD為1.20％，表明溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 總?cè)频暮辛繙y(cè)定 參考文獻(xiàn)［10］中的紫外分光光度法，其原理是利用三萜在無(wú)水條件下與強(qiáng)酸反應(yīng)，形成陽(yáng)碳離子鹽的顯色反應(yīng)。取雷公藤提取液適量，70℃下?lián)]干，加入5％香蘭素-冰醋酸溶液0.5 mL、高氯酸1.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱反應(yīng)15 min，取出，置于冰水浴中冷卻5 min，冰醋酸定容至5 mL，搖勻。以空白對(duì)照溶液為參比，測(cè)定其在530 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化雷公藤提取工藝研究 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲功率（A）、粉碎粒度（B）、提取時(shí)間（C）作為考察因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of response surface experiments

3 響應(yīng)面結(jié)果分析

3.1 模型與數(shù)據(jù)分析 由于去甲澤拉木醛為雷公藤三萜中的木栓烷型成分，故與總?cè)频奶崛⌒袨榫哂幸欢ǖ南嗨菩浴earson相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，兩者提取率（Y）的相關(guān)系數(shù)r為0.923，具有顯著性關(guān)系。

應(yīng)用Design-Expert8.0.5軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到去甲澤拉木醛的回歸方程為Y= 5.22 +0.14A +1.25B +0.16C +0.025AB -0.098AC+0.13BC+0.19 A2-2.12B2-0.11C2，總?cè)频幕貧w方程為Y=9.79 -0.14A+2.65 B+ 0.79 C+0.30AB+0.35AC+0.57BC+0.70 A2-3.48 B2+0.33C2。方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3　去甲澤拉木醛方差分析Tab.3 Analysis of variance for demethylzeylasteral

表4　總?cè)品讲罘治鯰ab.4 Analysis of variance for total triterpenoids

由表可知，整體模型的的p值均小于0.05，表明其效果顯著；相關(guān)系數(shù)r分別為0.982 7、0.948 4，表明該模型與實(shí)際擬合較好，誤差較小，可對(duì)雷公藤中去甲澤拉木醛和總?cè)频奶崛」に囘M(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。另外，粉碎粒度對(duì)雷公藤有效成分提取的影響最顯著，其次為提取時(shí)間和超聲功率。二次項(xiàng)中B2的偏回歸系數(shù)達(dá)到非常顯著的水平，而交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著。

3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design Expert軟件，得到去甲澤拉木醛和總?cè)频捻憫?yīng)曲面，見(jiàn)圖2和圖3，發(fā)現(xiàn)兩者在提取行為上一致。由圖可知，合適的藥材粉碎粒度對(duì)提取率有著非常顯著的影響，在0.5 mm左右時(shí)提取率最高，但粒度過(guò)大時(shí)將明顯下降。另外，超聲功率和提取時(shí)間對(duì)兩者的提取也有一定影響，高水平的2個(gè)因素能獲得更高的提取率。

3.3 最佳制備工藝驗(yàn)證 由于去甲澤拉木醛和總?cè)凭哂兴幚砘钚?，并且提取行為一致，故在進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，設(shè)定兩者同等的權(quán)重。采用Design-Expert軟件，結(jié)合實(shí)際操作情況，得到最佳提取工藝為超聲功率400 W，粉碎粒度30目，提取時(shí)間40 min。然后，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得去甲澤拉木醛和總?cè)频奶崛÷史謩e為（0.518± 0.006）％和（1.282±0.025）％，與兩者的預(yù)測(cè)值（0.567％和1.231％）較為接近。由此表明，該方程與實(shí)際情況擬合度良好，適用于回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

圖2　去甲澤拉木醛提取率的響應(yīng)面曲線圖Fig.2 Response surface curves for the extraction rate of demethylzeylasteral

圖3　雷公藤總?cè)铺崛÷实捻憫?yīng)面曲線圖Fig.3 Response surface curves for the extraction rate of total triterpenes

4 討論

由于中藥制劑成分復(fù)雜，其療效往往是多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)綜合作用的結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇去甲澤拉木醛與總?cè)谱鳛槔坠儆行С煞值奶崛≈笜?biāo)。目前，去甲澤拉木醛的提取方法主要為冷浸法［11］，而超聲提取在節(jié)省提取溶劑、時(shí)間，提高提取率的方面更具有優(yōu)勢(shì)。

在單因素試驗(yàn)中，考察了乙酸乙酯、丙酮、不同體積分?jǐn)?shù)和pH的乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)提取率依次為乙酸乙酯>丙酮>95％乙醇>80％乙醇> 60％乙醇。推測(cè)其原因，可能是去甲澤拉木醛和總?cè)频闹苄暂^強(qiáng)，易溶于乙酸乙酯，但由于其滲透力不強(qiáng)，故導(dǎo)致粒徑是提取率的重要影響因素。

由響應(yīng)面曲線圖可知，粉碎粒度對(duì)提取率影響顯著，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作情況，選擇過(guò)30目藥材顆粒作為工藝條件，取得了良好的效果。超聲提取藥材中的有效成分主要依賴(lài)其空化效應(yīng)及各種次效應(yīng)，有學(xué)者提出超聲提取藥物成分的縮核模型［15］。即顆粒內(nèi)部的“核”在超聲作用下不斷溶解縮小，并向外擴(kuò)散。如果粉碎粒度過(guò)大，則藥材總提取率主要由核界面層細(xì)胞的破壞速率決定，故減小藥材粒徑有利于其提??；當(dāng)粉碎粒度過(guò)小時(shí)，浸取的控制步驟不是核-殼界面細(xì)胞的破碎，而是有效成分由界面穿過(guò)殼層的擴(kuò)散，引起緊密堆積，導(dǎo)致局部有效濃度過(guò)大，從而降低提取率。

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［質(zhì) 量］

Optim izing ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wilfordii by response surfacemethod

XU Xiao-yong1， MA Feng-sen1，2*， FANG Jian-qiao2， LIANG Yi2， WU Xiao-juan1
（1.College of pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third HosPital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310009，China）

ABSTRACT：AIM To optimize the ultrasonic-assisted extraction of TriPterygium wifordii Hook.f..METHODS With total triterpenes and demethylzeylasteral as indices，aswell as influencing factors including ultrasonic power，grinded particle size and extraction time，the ultrasonic-assisted extraction of T.wifordii was optimized by response surfacemethod.RESULTS The optimized parameters were 400 W for ultrasonic power，30 mush for grinded particle size and 80 min for extraction time.The extraction rates of total triterpenes and demethylzeylasteral were（1.282±0.025）％and（0.518±0.006）％，respectively.CONCLUSION This simple and effective method holds its practical significance

KEY WORDS：TriPterygium wifordii Hook.f.；total triterpenoids；demethylzeylasteral；ultrasonic-assisted extraction；response surfacemethod

*通信作者：馬鳳森（1962—），男，教授，從事藥物新劑型研究。Tel：（0571）88871500，E-mail：merrigen@126.com

作者簡(jiǎn)介：徐曉勇（1991—），男，碩士生，從事藥物制劑新技術(shù)研究。Tel：15068857772，E-mail：xuxiaoyongjq@163.com

基金項(xiàng)目：浙江省重大科技專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2010C13014）；浙江省“重中之重”學(xué)科（針灸推拿學(xué)）開(kāi)放基金項(xiàng)目（ZTK2010A13）

收稿日期：2015-08-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.013

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1030-05