楊邦祝， 毛　羽， 沈睿娟， 李　艷， 林靈敏， 楊學軍， 朱　剛

（西南民族大學，四川成都610041）

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俄色葉-A毛囊靶向脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化

楊邦祝， 毛羽*， 沈睿娟， 李艷， 林靈敏， 楊學軍， 朱剛

（西南民族大學，四川成都610041）

摘要：目的 優(yōu)化俄色葉-A毛囊靶向脂質(zhì)體的制備工藝。方法 薄膜-超聲法制備脂質(zhì)體。以包封率為指標，單因素試驗和Box-Behnken效應面法優(yōu)化制備工藝。結果 最佳參數(shù)為卵磷脂與膽固醇比例5∶1，卵磷脂與藥物比例10∶1，緩沖液用量15 mL。包封率的預測值和實測值分別為91.8％和92.3％。脂質(zhì)體粒子呈球形，粒徑為（162.1±6.3）nm，Zeta電位為（-32.8±7.3）mV。結論 該制備工藝簡單可行，包封率高。

關鍵詞：俄色葉-A；毛囊靶向脂質(zhì)體；薄膜-超聲法；包封率；單因素試驗；Box-Behnken效應面法

藏藥俄色葉為薔薇科蘋果屬隴東海棠系植物變?nèi)~海棠Malus toringoides（Rehd.）Hughes或花葉海棠Malus transitoria（Batal.）Schneid的干燥葉，為高原藥食兩用植物，生長在海拔3 000～3 800 m之間，本課題組在2005年研究發(fā)現(xiàn)，俄色葉總黃酮具有降血糖、降血脂等作用，并系統(tǒng)進行了以俄色葉為主要原料的食品、保健食品、藥品等相關研究開發(fā)工作［1-2］。俄色葉-A是俄色葉黃酮中二氫查耳酮類化合物的衍生物，具有抗氧化和抗炎作用，外用治療痤瘡有著良好的效果。由于痤瘡的主要致病菌大多存在于皮膚毛囊中，故本實驗擬將該成分制備成外用的毛囊靶向制劑，以提高藥物的生物利用度。

由于脂質(zhì)體與生物膜具有相似的結構，組成脂質(zhì)體的類脂與皮膚角質(zhì)層有著高度的相似性，故能增加藥物在局部組織的積累，并延長藥物的作用時間［3-5］。研究表明，脂質(zhì)體有一定的毛囊靶向作用［6-8］，故將藥物制成脂質(zhì)體后可直接靶向于毛囊，延長在毛囊的作用時間，減少全身吸收，提高生物利用度，從而降低不良反應［9-10］。另外，俄色葉-A為淡黃色物質(zhì)，直接應用于臉部或身體其他部位皮膚會影響美觀，且會使衣物染色，故考慮將俄色葉-A包封于脂質(zhì)體中，制成外用的脂質(zhì)體制劑，在提高生物利用度的同時克服了外用的不方便性。本實驗考察了俄色葉-A脂質(zhì)體的制備方法，采取單因素結合響應面優(yōu)化法研究其制備過程中各影響因素對脂質(zhì)體包封率的影響，優(yōu)化制備工藝參數(shù)，為進一步研究該成分用機理及藥效提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

MS-2000激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；JEM-1200EX透射電鏡（日本電子株式會社）；AL104電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SENCO-R系列旋轉蒸發(fā)儀（上海申申科技有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（上海廣英儀器有限公司）；KQ-250B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters2695高效液相色譜儀，包括Waters2996 DAD檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）。葡聚糖凝膠G-50 （100～200目，臺州市路橋四甲生化塑料廠）；PVPK17聚乙烯吡咯烷酮（上海泰坦科技股份有限公司）。膽固醇、大豆卵磷脂、維生素E、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三氯甲烷、甲醇均為色譜純（成都市科龍化工試劑廠）；其他試劑均為分析純。俄色葉-A（自制）。

2 方法及結果

2.1 俄色葉-A包封率的測定

2.1.1 供試品溶液的制備

2.1.1.1 標準品溶液的制備 精密稱取對照品0.010 5 g，甲醇定容至10 mL，移液管精密量取2 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，得到0.21 mg/mL的對照品貯備液。

2.1.1.2 空白溶液的制備 薄膜-超聲法制備不含俄色葉-A的空白脂質(zhì)體，精密吸取0.1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，超聲破膜，搖勻，即得。

2.1.1.3 脂質(zhì)體溶液的制備 精密吸取樣品0.5 mL，加于凝膠柱內(nèi)徑與葡聚糖填充高度比為1.2∶5的Sephadex G-50凝膠柱（100～200 μm）頂部，磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）洗脫，體積流量1 mL/min，收集前17 mL洗脫液，搖勻，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，超聲破膜，搖勻，即得分離后的脂質(zhì)體溶液。另取脂質(zhì)體0.5 mL，磷酸鹽溶液稀釋至17 mL，取1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，超聲破膜，搖勻，即得未分離的脂質(zhì)體溶液。

2.1.1.4 脂質(zhì)體包封率測定 取“2.1.1.3”項下脂質(zhì)體溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法測定峰面積，代入標準曲線，計算俄色葉-A含有量。然后，計算包封率，公式如下。

2.1.2 HPLC法的建立及驗證

2.1.2.1 最大吸收波長的確定 取“2.1.1”項下標準品溶液，甲醇作為空白，紫外分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)全波長掃描，測定對照品中俄色葉-A的吸光度，最終確定最大吸收波長為283 nm。

2.1.2.2 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×46 mm，5 μm）；體積流量0.8 mL/min；柱溫25℃；檢測波長283 nm；流動相甲醇-水（40∶60）。

2.1.2.3 專屬性考察 取“2.1.1”項下標準品溶液、空白溶液及分離前的脂質(zhì)體溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC法測定其吸收峰。結果，在“2.1.2.2”項色譜條件下，空白脂質(zhì)體無吸收，說明輔料對主藥的測定無干擾，具體見圖1。

2.1.2.4 標準曲線的繪制 取“2.1.1”項下標準品溶液，將其分別稀釋1.25、1.75、2.5、5和10倍，得到0.168、0.120、0.084、0.042和0.021 mg/mL 5個質(zhì)量濃度，0.45 μm微孔濾膜過濾，分別進樣10 μL，HPLC法測定峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）作標準曲線，得線性回歸方程為Y=3×106X-189 358（R2=0.999 9），表明俄色葉-A在0.04～0.24 g/L范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.2.5 精密度試驗 取“2.1.1”項下標準品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣10 μL，重復進樣5次，HPLC法測定峰面積。結果，RSD值為0.22％，表明儀器精密度良好。

2.1.2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.1”項下標準品溶液和未分離的脂質(zhì)體溶液，室溫放置1、2、4、6、8、12、24、48、72 h后，0.45 μm微孔濾膜過濾，分別進樣10 μL進行測定，記錄峰面積。結果，兩者RSD分別為1.42％和2.43％，表明溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1　HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.1.2.7 加樣回收率試驗 取含有量已知的脂質(zhì)體溶液6份，分別精密加入俄色葉-A標準品50 mg，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2.2”項色譜條件下測定，結果見表1。

表1　加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests

2.2 俄色葉-A脂質(zhì)體的制備方法

2.2.1 薄膜分散法 精密稱取膽固醇、卵磷脂和俄色葉-A適量，以及聚乙烯吡咯烷酮10 mg，氯仿-甲醇（2∶1）溶解，再轉移至500 mL茄形瓶中，40℃下蒸干有機溶劑至瓶壁上形成一層均一的薄膜，將適量磷酸鹽緩沖液倒入茄形瓶中，室溫下振搖以洗下薄膜，轉入錐形瓶中，50℃下磁力攪拌1 h，即得。

2.2.2 乙醚注入法 精密稱取膽固醇、卵磷脂和俄色葉-A適量，溶于乙醚中。再取聚乙烯吡咯烷酮10 mg，溶于緩沖溶液中。水相置于60℃恒溫水浴鍋中，乙醚溶液用注射器緩慢均勻注入緩沖溶液，攪拌揮干乙醚，超聲20 min，即得。

2.2.3 薄膜-超聲法 將“2.1.1”項下脂質(zhì)體置于恒溫水浴中，超聲一定時間，依次過0.80、0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 制備方法比較 薄膜分散法制備的脂質(zhì)體包封率最高，穩(wěn)定性好，但粒徑較大（大于600 nm）；乙醚注入法制備的脂質(zhì)體包封率只有61％，而且粒徑不均勻，4℃放置7 d后有少量聚集沉淀，脂質(zhì)體不穩(wěn)定；薄膜-超聲法制備的脂質(zhì)體粒徑小，而且均勻，包封率為86％，4℃下放置7 d后脂質(zhì)體無凝聚，穩(wěn)定性較好。綜合考慮包封率、粒徑和穩(wěn)定性，最終選擇薄膜-超聲法，并進行工藝優(yōu)化。

2.3 單因素考察試驗及結果 固定其他因素，分別考察卵磷脂與膽固醇比例、卵磷脂與主藥比例、溶劑用量、緩沖液pH、緩沖液用量、超聲時間對脂質(zhì)體包封率的影響。

固定因素為旋蒸溫度40℃，轉速100 r/min，水化溫度50℃，時間1 h，聚乙烯吡咯烷酮10 mg，維生素E 1滴。當其為非考察因素時，分別固定為卵磷脂與膽固醇比例5∶1，卵磷脂與主藥比例5∶1，溶劑用量30 mL，緩沖液pH 7.0，緩沖液用量10 mL，超聲時間30 min；當其為考察變量時，分別取值為卵磷脂與膽固醇比例（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9），卵磷脂與主藥比例（1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20），溶劑用量（9、15、30、45、60 mL），緩沖液pH值（5.8、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4），緩沖液用量（5、10、15、20、25、30 mL），超聲時間（0、10、20、30、40、50 min）。各組實驗均按“2.3”項下方法測定俄色葉-A脂質(zhì)體的包封率，以該變量為橫坐標，包封率為縱坐標作圖，結果見圖2。

由圖可知，溶劑用量在30 mL后，脂質(zhì)體包封率值只有小幅度增加，考慮結果及節(jié)約原料，將溶劑用量定為30 mL。緩沖液pH值為7.0時，脂質(zhì)體較穩(wěn)定，包封率在長時間內(nèi)保持較高，而其他pH下脂質(zhì)體易絮凝，出現(xiàn)沉淀，包封率在短時間內(nèi)急劇下降，因此選擇pH值7.0的緩沖液作為水化溶液。包封率隨超聲時間的增加而減少，20 min后下降明顯，考慮保持小粒徑脂質(zhì)體和高包封率，將超聲時間定為20 min。卵磷脂與膽固醇比例、卵磷脂與主藥比例及緩沖液用量對包封率影響較大，而且規(guī)律不明顯，故以三者為響應面設計優(yōu)化法考察的因素。

圖2　各因素對包封率的影響Fig.2 Effects of various factors on entrapment efficiency

2.4 響應面試驗設計及結果 基于單因素考察結果，選出對脂質(zhì)體包封率影響較明顯的因素，即卵磷脂與膽固醇比例（A）、卵磷脂與主藥比例（B）、緩沖液用量（C），每個因素取3個水平進行工藝優(yōu)選，因素水平及結果見表2～4。

各因素經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程為包封率=90.62 +2.21A+0.86B-1.17C+2.08AB-3.15AC+4.15BC-5.25A2-7.10B2-1.47C2，具有極顯著性（pr>F小于0.001），R20.966 5表明模型響應值變化的96.65％來自所選因變量，失擬差不顯著（pr>F大于0.05）表明本模型沒有失擬現(xiàn)象，可充分反映實際情況。綜上所述，該模型可用于對俄色葉-A的包封率進行分析和預測。

表2　因素水平Tab.2 Factors and levels

表3　試驗設計和結果Tab.3 Design and results of tests

表4　方差分析Tab.4 Analysis of variance

根據(jù)回歸方程，研究響應面圖，分析膽卵比、脂藥比、緩沖液用量對俄色葉-A脂質(zhì)體影響，結果見圖3。本實驗選擇卵磷脂與膽固醇比例5∶1、卵磷脂與主藥比例10∶1及緩沖液用量15 mL作為俄色葉-A脂質(zhì)體的優(yōu)化工藝參數(shù)。根據(jù)上述條件制備3批樣品，分別測定其包封率，結果預測值為91.8％，實測值為92.3％，兩者偏差率為0.54％，說明該模型比較可靠。

圖3　包封率的三維效應面圖Fig.3 3D response surface plots of entrapment efficiency

2.5 脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑和Zeta電位 取俄色葉-A脂質(zhì)體適量，加雙蒸水稀釋200倍，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，2％醋酸雙氧鈾負染，透射電鏡下觀察其粒徑及形態(tài)，激光粒徑分析儀測定其平均粒徑分布和Zeta電位。結果表明，粒徑為（162.1± 6.3）nm，多分散系數(shù)為0.12，Zeta電位為（-32.8±7.3）mV。見圖4。

2.6 脂質(zhì)體初步穩(wěn)定性考察 按優(yōu)化后的最佳處方和工藝制備俄色葉-A脂質(zhì)體，密封于西林瓶中，4℃下保存，分別于0、1、2、4、6月末取樣，對其外觀、粒徑分布、Zeta電位值和脂質(zhì)體包封率進行考察。結果，其外觀仍為均一乳白色混懸液，無聚集沉淀，各項考察指標值基本不變，說明俄色葉-A脂質(zhì)體在4℃條件下于6個月內(nèi)穩(wěn)定。具體見表5。

表5　俄色葉-A脂質(zhì)體穩(wěn)定性試驗結果（±s）Tab.5 Results of stability tests for eseye-A liposomes（χ± s）

表5　俄色葉-A脂質(zhì)體穩(wěn)定性試驗結果（±s）Tab.5 Results of stability tests for eseye-A liposomes（χ± s）

時間/月　　粒徑/nm　 Zeta電位/mV　　包封率/％ 0　162.1±6.3　 -32.8±7.3　92.30 1　160.0±7.8　 -32.5±8.7　92.24 2　165.1±5.6　 -31.8±6.9　92.29 4　163.2±6.3　 -31.2±7.2　92.31 6　166.5±9.5　 -31.0±6.8　92.28

3 討論

影響脂質(zhì)體包封率的因素有很多，如藥物的性質(zhì)、藥物與脂質(zhì)體的比例、脂質(zhì)體的種類和用量、制備方法等。其中，藥物的性質(zhì)是影響脂質(zhì)體包封率的主要因素，極性藥物在水中的溶解度越大，在脂質(zhì)體水相中的質(zhì)量濃度越高，包封體積越大，包封的極性藥物越多；非極性藥物脂溶性越大，脂質(zhì)體雙分子層中包封量越多，藥物電性與脂質(zhì)體膜電性相反。當藥物與類脂雙分子的親和力增加時，包封率提高，反之則下降。另外，分子量大的藥物可獲得較高的包封率。俄色葉-A的油水分配系數(shù)lgP值為6.0，脂溶性很好，可包封成較高包封率的穩(wěn)定脂質(zhì)體［11］。因此，選擇合適的輔料及制備工藝能制得包封率較高的俄色葉-A脂質(zhì)體。

圖4　透射電鏡照片、粒徑分布和Zeta電位Fig.4 Transm ission electron m icroscope photograph，size distribution and Zeta potential

響應面設計法可評價因素和指標間的非線性關系，與國內(nèi)常采用的正交設計、均勻設計相比，具有精度高、預測性好、簡單和直觀的優(yōu)點，目前已廣泛用于藥物處方篩選、劑型制備、生物過程以及化學合成的優(yōu)化［12］。本實驗采用響應面設計法優(yōu)化俄色葉-A脂質(zhì)體的制備工藝，得到最佳處方為卵磷脂與膽固醇比例5∶1，卵磷脂與藥物比例10∶1，緩沖液用量15 mL。根據(jù)該優(yōu)化條件制備3批樣品，分別測定其包封率，結果預測值為91.8％，實測值為92.3％，兩者偏差率為0.54％，表明該方法可用于俄色葉-A脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化。

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Optim izing the preparation process of eseye-A hair follicle-targeted liposomes

YANG Bang-zhu， MAO Yu*， SHEN Rui-juan， LI Yan， LIN Ling-min， YANG Xue-jun，ZHU Gang
（Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

ABSTRACT：AIM To optimize the preparation process of eseye-A hair follicle-targeted liposomes.METHODS The liposomes were prepared by film-ultrasonic method.With encapsulation efficiency as an index，the preparation process was optimized by single factor experiment and Box-Behnken response surface method. RESULTS The optimized parameterswere 5∶1 for ratio of lecithin to cholesterol，10∶1 for ratio of lecithin to drug and 15 m L for the amount of buffer solution.The predictive value and measured value were 91.8％and 92.3％，respectively.The spherical liposome particle had particle size of（162.1±6.3）nm and Zeta potential of（-32.8±7.3）mV.CONCLUSION This simple and feasible preparation process ensures a high encapsulation efficiency.

KEY WORDS：eseye-A；hair follicle-targeted liposomes；film-ultrasonicmethod；encapsulation efficiency；single factor experiment；Box-Behnken response surfacemethod

*通信作者：毛 羽（1962—），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為民族藥新藥研發(fā)。Tel：15680081119，E-mail：yumao192000@126.com

作者簡介：楊邦祝（1990—），女，碩士，研究方向為民族藥新藥研發(fā)。Tel：15184386958，E-mail：707504457@qq.com

基金項目：西南民族大學2015級研究生創(chuàng)新型科研項目（CX2015SZ060）

收稿日期：2015-12-28

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.011

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-1018-06