康玉霞， 雷　丸， 王　濟(jì)， 王曉娟*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng)712046；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

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姜黃素納米脂質(zhì)載體的制備、優(yōu)化及體外評(píng)價(jià)

康玉霞1，2， 雷丸1，2， 王濟(jì)2， 王曉娟2*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng)712046；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，陜西西安710032）

摘要：目的 制備、優(yōu)化姜黃素納米脂質(zhì)載體，并進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。方法 薄膜分散法制備姜黃素納米脂質(zhì)載體后，以粒徑和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，單因素和正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方和制備工藝。透射電鏡觀察其外觀形態(tài)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑、粒徑分布及Zeta電位，透析法測(cè)定其體外釋放行為。結(jié)果 最優(yōu)條件為投藥量10 mg，固液比2∶5，超聲時(shí)間6 min，磷酸緩沖溶液pH值6.5。不同磷脂酰絲氨酸比例（0％、4％、8％、12％）修飾的載體呈球形或類球形，分布均勻，平均粒徑分別為（212.1±1.4）、（210.5±1.3）、（207.6±1.7）、（198.4±1.7）nm，Zeta電位分別為（-1.33±0.39）、（-18.01±0.41）、（-45.31±0.36）、（-45.56±0.41）mV，包封率分別為（85.64± 0.67）％、（86.13±0.56）％、（88.38±0.34）％、（88.78±0.58）％，載藥量分別為（2.23±0.03）％、（2.15± 0.03）％、（2.19±0.04）％、（2.18±0.02）％，具有明顯的緩釋特性。結(jié)論 制備的姜黃素納米脂質(zhì)載體粒徑分布均勻，包封率和載藥量均良好。

關(guān)鍵詞：姜黃素納米脂質(zhì)載體；制備；優(yōu)化；體外評(píng)價(jià)；薄膜分散法；單因素；正交設(shè)計(jì)

姜黃素是從姜科植物姜黃Curcuma longa根莖中提取出的一種多酚類天然藥物［1］，為姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分［2］。姜黃作為一種傳統(tǒng)中藥，其味辛、苦、溫，歸脾、肝經(jīng)［1］，具有行風(fēng)、散風(fēng)活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效［3］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗凝血、清除自由基、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多方面的藥理作用［4-5］，而且毒性低，不良反應(yīng)少，已成為研究的熱點(diǎn)［6］。但是，該成分幾乎不溶于水，易溶于乙醇、醋酸、丙酮、氯仿等溶劑，易見(jiàn)光分解，在中性和堿性條件下不穩(wěn)定［2］，這些缺點(diǎn)也限制了其應(yīng)用。因此，迫切需要運(yùn)用藥劑學(xué)的手段來(lái)改善姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性。

磷脂酰絲氨酸大量存在于凋亡細(xì)胞的外膜［7-8］，能高效識(shí)別巨噬細(xì)胞上的受體而實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞靶向性［7］，誘導(dǎo)生物體內(nèi)凋亡細(xì)胞的清除［8-9］，而巨噬細(xì)胞又是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的主要炎癥細(xì)胞［8］。因此，將采用生物內(nèi)源性的磷脂酰絲氨酸作為膜材修飾納米粒，以具有明顯抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的姜黃素為模型藥物進(jìn)行包載，制備磷脂酰絲氨酸修飾的姜黃素納米粒。期冀不僅可以提高姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性，還可以借助磷脂酰絲氨酸介導(dǎo)的靶向巨噬細(xì)胞作用來(lái)增加納米粒斑塊靶向性，進(jìn)而更好地發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的療效。

1 儀器與材料

BT125D電子天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；KQ5200E超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SENCO?R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；UV/VIS Lambda35紫外光譜儀（珀金埃爾默責(zé)任有限公司）；YJ96-Ⅱ超聲細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Nano-ZS90激光粒度分析儀（英國(guó)馬爾文公司）；LC-2010A高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；LD5-10低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。姜黃素對(duì)照品（含有量98.9％，批號(hào)110823-201405，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；姜黃素原料藥（含有量98％，阿拉丁試劑上海有限公司）；大豆磷脂S100（含有量97％，德國(guó)Lipoid公司）；磷脂酰絲氨酸（含有量>70％，上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司）；三油酸甘油酯（上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；膽固醇（含有量99％，日本精細(xì)化工株式會(huì)社）；膽固醇油酸酯（含有量97％，美國(guó)Alfa Aesar公司）。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素納米脂質(zhì)載體的制備 分別精密稱取處方量的大豆磷脂、磷脂酰絲氨酸、三油酸甘油酯、膽固醇、膽固醇油酸酯和姜黃素原料藥混合物，加10 mL氯仿超聲溶解，55℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中揮去有機(jī)溶劑，得到干燥的脂質(zhì)薄膜。在30℃下，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.5）對(duì)脂質(zhì)薄膜進(jìn)行30 min水化，脂質(zhì)混懸液超聲處理10 min，再進(jìn)行探頭超聲（300 W）6 min。最后，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，同時(shí)使粒徑均勻。

2.2 包封率的測(cè)定

2.2.1 葡聚糖凝膠微柱對(duì)空白納米脂質(zhì)載體的吸附取空白納米脂質(zhì)載體樣品0.5 mL，滴加到葡聚糖凝膠微柱中心，1 000 r/min離心2 min，然后每次補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水洗脫2 min，收集帶有乳光的洗脫液，無(wú)水乙醇破乳定容，在541 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1。再取樣品0.5 mL，無(wú)水乙醇破乳定容，同法測(cè)定吸光度A2。計(jì)算空白納米脂質(zhì)載體的回收率［（A1/A2）×100％］，平均值為98.9％，RSD為0.59％（n =3），表明微柱對(duì)其幾乎無(wú)吸附作用。

2.2.2 葡聚糖凝膠微柱對(duì)姜黃素游離藥物的吸附 取與載體等質(zhì)量濃度的姜黃素溶液0.5 mL，滴加到微柱中心，1 000 r/min離心2 min，然后每次補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水洗脫2 min，合并洗脫液，無(wú)水乙醇定容，在426 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A1。再取0.5 mL，無(wú)水乙醇定容，同法測(cè)定吸光度A2，計(jì)算微柱對(duì)姜黃素游離藥物的吸附率，公式為［（A2-A1）/A2］×100％，測(cè)得平均值為98.3％，RSD為0.67％（n =3）。

2.2.3 葡聚糖凝膠微柱對(duì)姜黃素和空白納米脂質(zhì)載體物理混合物的吸附 取姜黃素溶液適量，加到空白載體中，取0.5 mL滴加到微柱中心，1 000 r/min離心2 min，然后每次補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水洗脫2 min，收集帶有乳光的部分，無(wú)水乙醇破乳定容，在426 nm波長(zhǎng)處測(cè)定姜黃素的吸光度A1。再取0.5 mL，無(wú)水乙醇破乳定容，同法測(cè)定吸光度A2，計(jì)算微柱對(duì)混合物中姜黃素的吸附率，公式為［（A2-A1）/A2］×100％，測(cè)得平均值為97.8％，RSD為1.04％（n =3），表明葡聚糖凝膠微柱能將混合物中的游離藥物吸附截留。

2.2.4 分離效果驗(yàn)證 取姜黃素納米脂質(zhì)載體樣品0.5 mL，滴加到葡聚糖凝膠微柱中心，1 000 r/min離心2 min，然后每次補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水洗脫2 min至不再有乳光產(chǎn)生，0.5 mL 30％乙醇溶液洗脫2 min，收集每管洗脫液，無(wú)水乙醇定容，搖勻，過(guò)濾，測(cè)定吸光度。洗脫曲線見(jiàn)圖1。

圖1　洗脫曲線Fig.1 Elution curve

由圖可知，姜黃素納米脂質(zhì)載體的出峰集中在第1管和第2管，在第三次離心后已完全洗脫；游離的姜黃素溶液在第10次離心時(shí)才大量被洗脫出來(lái)，表明葡聚糖微柱能將兩者很好地分離開(kāi)。

2.2.5 姜黃素納米脂質(zhì)載體包封率和載藥量的測(cè)定 分別取姜黃素對(duì)照品及空白載體適量，無(wú)水乙醇溶解稀釋后過(guò)濾，在300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果，姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)為426 nm，空白載體不干擾姜黃素的測(cè)定，見(jiàn)圖2。另取對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇配制成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.170 2X-0.016 9（r=0.999 7），表明姜黃素在1.044～7.308 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度和回收率均良好，RSD小于2％，符合含有量測(cè)定方法學(xué)的要求。

圖2　紫外掃描圖譜Fig.2 Ultraviolet scanning profiles

取姜黃素納米脂質(zhì)載體樣品0.5 mL，滴加到微柱中心，1 000 r/min離心2 min，然后每次補(bǔ)充0.5 mL蒸餾水洗脫2 min，收集帶有乳光的部分，置于100 mL量瓶中，無(wú)水乙醇破乳定容，搖勻，過(guò)濾，測(cè)定吸光度，測(cè)定姜黃素的質(zhì)量濃度為2.85 μg/mL，按下式計(jì)算包封率（EE）和載藥量（LD）。

其中，m為藥物量，m1為投藥量，m2為載體材料質(zhì)量。

2.3 單因素考察

2.3.1 磷脂酰絲氨酸/磷脂摩爾比例的確定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用薄膜分散法制備磷脂酰絲氨酸修飾的姜黃素納米脂質(zhì)載體。固定其他條件，制備磷脂酰絲氨酸比例分別為0％、4％、8％、12％、20％的納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表可知，當(dāng)磷脂酰絲氨酸比例在0％～12％時(shí)，對(duì)藥物粒徑和包封率的影響不大；但當(dāng)在20％時(shí)，包封率顯著減小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇磷脂酰絲氨酸的比例分別為0％、4％、8％和12％。

表1　不同比例磷脂酰絲氨酸對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.1 Effects of different ratios of phosphatidylserine on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency（n=3）

另外，在考察磷脂酰絲氨酸修飾的姜黃素納米脂質(zhì)載體制備工藝和處方因素時(shí)，固定磷脂酰絲氨酸用量為8％，以粒徑和包封率為考察指標(biāo)來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2 成膜溫度 固定其它條件，以55、65、75、85℃的成膜溫度分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　不同成膜溫度對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.2 Effects of different film-form ing tem peratures on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency（n=3）

由表可知，隨著成膜溫度的升高，包封率呈下降的趨勢(shì)，可能是由于溫度過(guò)高，導(dǎo)致藥物和脂質(zhì)發(fā)生氧化的緣故。因此，成膜溫度選擇55℃。

2.3.3 水合時(shí)間 固定其它條件，以15 min、30 min、1 h、1.5 h水合時(shí)間分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.2”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同水合時(shí)間對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.3 Effects of different hydration time on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency （n=3）

由表可知，水合時(shí)間為15 min時(shí)，包封率較低，可能是藥物未能與脂質(zhì)充分接觸，水合不完全；在30 min時(shí)，包封率增大；但繼續(xù)延長(zhǎng)后，粒徑和包封率無(wú)明顯變化，故水合時(shí)間選擇30 min。

2.3.4 超聲時(shí)間 固定其它條件，以3、6、9、12 min超聲時(shí)間分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　不同超聲時(shí)間對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.4 Effects of different ultrasonic time on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency （n=3）

由表可知，超聲時(shí)間對(duì)粒徑和包封率均有較大的影響，隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)，兩者均呈下降的趨勢(shì)。綜合分析，超聲時(shí)間應(yīng)控制在3～9 min，具體情況有待作進(jìn)一步考察。

2.3.5 投藥量 固定其它條件，以5、10、15、20 mg投藥量分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　不同投藥量對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.5 Effects of different dosages on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency （n=3）

由表可知，投藥量對(duì)粒徑和包封率均有較大影響。當(dāng)投藥量在15 mg以下時(shí)，粒徑逐漸增大，包封率先增大后減??；當(dāng)在15 mg以上時(shí)，粒徑減小，但包封率也較低。因此，投藥量應(yīng)控制在10 mg左右，具體情況有待作進(jìn)一步考察。

2.3.6 固液態(tài)脂質(zhì)比 固定其它條件，以2∶1、2∶3、2∶5、2∶7固液比分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　不同固液比對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.6 Effects of different ratios of solid to liquid on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency（n=3）

由表可知，固液比對(duì)粒徑影響不大，但對(duì)包封率有較大影響。隨著液態(tài)脂質(zhì)比例的增加，包封率先增大后減小，最終將固液比控制在2∶5左右的范圍內(nèi)，具體情況有待作進(jìn)一步考察。

2.3.7 磷酸緩沖溶液的pH值 固定其它條件，以pH值5.0、6.5、7.0、7.4的磷酸緩沖溶液分別制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，制備方法同“2.1”項(xiàng)，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑。然后，測(cè)定其包封率，方法同“2.2.5”項(xiàng)。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7　不同pH值磷酸緩沖溶液對(duì)粒徑、多分散系數(shù)及包封率的影響（n=3）Tab.7 Effects of different pH values of phosphate buffer solution on particle size，polydispersity index and entrapment efficiency（n=3）

由表可知，磷酸緩沖溶液的pH值對(duì)粒徑和包封率均有較大影響。pH為6.5時(shí)，粒徑較小，而且包封率較高；當(dāng)pH值進(jìn)一步增加時(shí)，包封率下降，可能是由于姜黃素在中性條件下不穩(wěn)定，導(dǎo)致包封率較低。因此，將磷酸緩沖溶液的pH值控制在6.5左右，具體情況有待作進(jìn)一步考察。

2.4 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方和制備工藝

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考察的結(jié)果，選擇影響姜黃素納米脂質(zhì)載體粒徑和包封率的4個(gè)主要參數(shù)作為考察對(duì)象，即投藥量（A）、固液比（B）、超聲時(shí)間（C）、磷酸緩沖溶液的pH值（D），每個(gè)因素選取3個(gè)水平，按正交設(shè)計(jì)L9（34）表進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)選最佳處方和制備工藝。因素水平見(jiàn)表8。

表8　因素水平Tab.8 Factors and levels

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表8，采用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ?qū)I(yè)版軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，按照軟件給出的結(jié)果制備姜黃素納米脂質(zhì)載體，并測(cè)定包封率。結(jié)果見(jiàn)表9，方差分析見(jiàn)表10。

表9　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.9 Results of orthogonal tests

表10　方差分析Tab.10 Analysis of variance

由表9可知，各因素對(duì)包封率的影響依次為A>C>D>B，即投藥量的影響最大，其次是超聲時(shí)間，再次是磷酸緩沖溶液的pH值，而固液比的影響最小。

由表10可知，投藥量和超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響均具有顯著性差異（p<0.05）。按照正交試驗(yàn)結(jié)果，最優(yōu)工藝條件為A1B2C2D2，即投藥量為10 mg，固液比為2∶5，超聲時(shí)間為6 min，磷酸緩沖溶液的pH值為6.5。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合既定的工藝和參數(shù)，按照最佳處方和工藝條件，制備3批姜黃素納米脂質(zhì)載體，并測(cè)定包封率，結(jié)果見(jiàn)表11。由表可知，在優(yōu)化工藝條件下的平均包封率為88.78％，而且較為穩(wěn)定，粒徑和載藥量均較為理想，說(shuō)明該方案可行，而且工藝的重復(fù)性良好。

表11　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.11 Results of verification tests（n=3）

2.5 姜黃素納米脂質(zhì)載體理化性質(zhì)的表征

2.5.1 形態(tài)學(xué)研究 在最佳處方和制備工藝條件下，制備不同磷脂酰絲氨酸比例的姜黃素納米脂質(zhì)載體，分別用適量去離子水稀釋至一定倍數(shù)，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，晾干，透射電鏡下觀察形態(tài)和大小，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，姜黃素納米脂質(zhì)載體為黑色類球形的實(shí)心結(jié)構(gòu)，大小均一。

圖3　透射電鏡圖Fig.3 Transm ission electron m icroscope images

2.5.2 粒徑和Zeta電位的測(cè)定 在最佳處方和制備工藝條件下，制備不同磷脂酰絲氨酸比例的姜黃素納米脂質(zhì)載體，用適量去離子水稀釋后，激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑和Zeta電位，結(jié)果見(jiàn)表12。由表可知，隨著磷脂酰絲氨酸比例的增加，Zeta電位呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明已成功插入磷脂單層膜中；當(dāng)磷脂酰絲氨酸比例大于8％時(shí)，Zeta電位趨于恒定，說(shuō)明已達(dá)到飽和狀態(tài)。

表12　不同磷脂酰絲氨酸比例對(duì)粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位的影響（±s，n=3）Tab.12 Effects of different ratios of phosphatidylserine on particle size，polydispersity index and Zeta potential（±s，n=3）

表12　不同磷脂酰絲氨酸比例對(duì)粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位的影響（±s，n=3）Tab.12 Effects of different ratios of phosphatidylserine on particle size，polydispersity index and Zeta potential（±s，n=3）

磷脂酰絲氨酸/％　粒徑/nm　多分散系數(shù)　　電位/mV 0 212.1±1.4 0.006±0.001 -1.33±0.39 4 210.5±1.3 0.010±0.003 -18.01±0.41 8 207.6±1.7 0.044±0.002 -45.31±0.36 12　198.4±1.7 0.087±0.003 -45.56±0.41

2.5.3 包封率和載藥量的測(cè)定 在最佳處方和制備工藝條件下，制備不同磷脂酰絲氨酸比例的姜黃素納米脂質(zhì)載體，測(cè)定藥物的包封率和載藥量，方法同“2.2.5”項(xiàng)，結(jié)果見(jiàn)表13。

表13　不同磷脂酰絲氨酸比例對(duì)包封率和載藥量的影響（±s，n=3）Tab.13 Effects of different ratios of phosphatidylserine on entrapment efficiency and drug loading（±s，n=3）

表13　不同磷脂酰絲氨酸比例對(duì)包封率和載藥量的影響（±s，n=3）Tab.13 Effects of different ratios of phosphatidylserine on entrapment efficiency and drug loading（±s，n=3）

磷脂酰絲氨酸/％　　包封率/％　　載藥量/％ 0 85.64±0.67　2.23±0.03 4 86.13±0.56　2.15±0.03 8 88.38±0.34　2.19±0.04 12　88.78±0.58　2.18±0.02

2.5.4 體外釋放 以含5％十二烷基硫酸鈉的磷酸緩沖溶液（0.05 mol/L，pH=6.5）200 mL為釋放介質(zhì)，水浴恒溫振蕩，100次/min，溫度（37.0±0.5）℃。吸取含不同磷脂酰絲氨酸比例的載體樣品溶液3 mL，裝入釋放介質(zhì)浸泡過(guò)夜的透析袋（8 000～14 000 Da）中，透析夾夾緊，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、96、120 h吸取釋放液2 mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按下述色譜條件測(cè)定姜黃素的含有量。同時(shí)，補(bǔ)充等量同溫的新鮮釋放介質(zhì)，按下式計(jì)算各取樣點(diǎn)各樣品的累積釋放率。釋放曲線見(jiàn)圖4。

色譜條件為Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-4％冰醋酸（48∶52）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm；進(jìn)樣量為20 μL，空白載體、釋放介質(zhì)均不干擾姜黃素的測(cè)定。另取姜黃素對(duì)照品適量，加無(wú)水乙醇配制成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。以姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 147 945X-8 514.9（r=0.999 8），表明姜黃素在0.01～4.93 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其精密度和回收率均良好，RSD小于2％，符合含有量測(cè)定方法學(xué)的要求。

圖4　累計(jì)釋放曲線（n=3）Fig.4 Accumulative release curves（n=3）

由圖可知，不同磷脂酰絲氨酸比例的姜黃素納米脂質(zhì)載體均表現(xiàn)出明顯的緩釋特性，并且隨著其比例的增加，藥物的釋放逐漸加快，可能是由于磷脂酰絲氨酸的插入導(dǎo)致磷脂單層膜的排列緊密度降低，使得藥物較快地從磷脂單層膜中釋放出來(lái)。體外釋藥曲線方程擬合結(jié)果表明，不同磷脂酰絲氨酸比例姜黃素納米脂質(zhì)載體的體外釋放曲線均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。

3 討論

關(guān)于制備方法的選擇，本實(shí)驗(yàn)考察了乳化蒸發(fā)法-低溫固化法［10］、溶劑擴(kuò)散法［11］、薄膜分散法［12］，由于所采用的有機(jī)溶劑為氯仿，與水互不相溶，而且前兩種方法的有機(jī)相與水相混合時(shí)，會(huì)有顆粒析出，故選擇薄膜分散法。

本實(shí)驗(yàn)采用生物相容性的脂質(zhì)為膜材，對(duì)姜黃素進(jìn)行包載，制備納米脂質(zhì)載體，水合介質(zhì)為pH 6.5的磷酸緩沖溶液，可直接用于注射給藥，改善了姜黃素水溶性差、易見(jiàn)光分解、在中性介質(zhì)中不穩(wěn)定等不足之處。

在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)姜黃素納米脂質(zhì)載體粒徑和包封率影響最顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出最佳處方和制備工藝為投藥量10 mg，固液比2∶5，超聲時(shí)間6 min，磷酸緩沖溶液pH值6.5。通過(guò)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該工藝優(yōu)越、合理、可重復(fù)性高，可作為篩選處方和工藝的一種切實(shí)有效的手段。

在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，不同磷脂酰絲氨酸比例的姜黃素納米脂質(zhì)載體在120 h內(nèi)的累計(jì)釋放量約為40％，具有明顯的緩釋特性，并且體外釋放曲線均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)一步表明該載藥系統(tǒng)符合緩釋型釋藥系統(tǒng)。

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選出最佳處方和制備工藝。所得的姜黃素納米脂質(zhì)載體外觀性狀良好，粒徑較小，而且分布均勻，包封率和載藥量均較為理想，4℃下放置1周后性質(zhì)穩(wěn)定，表明該工藝參數(shù)合理，可為后續(xù)的研究提供可靠的制劑保障。

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Preparation，optim ization and in vitro evaluation of curcum in-loaded nanostructured lipid carriers

KANG Yu-xia1，2， LEIWan1，2， WANG Ji2， WANG Xiao-juan2*
（1.ShaanxiUniversity of ChineseMedicine，Xianyang 712046，China；2.State Key Laboratory ofMilitary Stomatology；DePartmentof pharmacy，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China）

ABSTRACT：AIM To prepare and optimize curcumin-loaded nanostructured lipid carriers and to evaluate in vitro performance.METHODS For curcumin-loaded nanostructured lipid carriers prepared by film dispersion method，single factor test and orthogonal design method were applied to optimizing its formulation and preparation technology，with regard to indices of particle size and encapsulation efficiency.Themorphologywas studied by transmission electron microscopy，while the particle size，particle distribution and Zeta potentialwere determined by laser particle size analyzer，and the in vitro drug release behavior was investigated by dialysismethod.RESULTS The following conditions were 10 mg for dosage，2∶5 for ratio of solid to liquid，6 min for extraction time and 6.5 for pH value of phosphate buffer solution.The carriersmodified by different ratios of phosphatidylserine（0％，4％，8％and 12％）were spherical or approximately spherical with homogeneous distribution.The mean sizes were （212.1±1.4）nm，（210.5±1.3）nm，（207.6±1.7）nmand（198.4±1.7）nm，the Zeta potentials were （-1.33±0.39）mV，（-18.01±0.41）mV，（-45.31±0.36）mVand（-45.56±0.41）mV，the encapsulation efficiencies were（85.64±0.67）％，（86.13±0.56）％，（88.38±0.34）％and（88.78± 0.58）％，and the drug loading capacities were（2.23±0.03）％，（2.15±0.03）％，（2.19±0.04）％andbook=1012,ebook=58（2.18±0.02）％，respectively.An obvious slow-release characterwas observed.CONCLUSION The obtained curcumin-loaded nanostructured lipid carriers display a uniform particle size distribution with high encapsulation efficiency and drug loading capacity.

KEY WORDS：curcumin-loaded nanostructured lipid carriers；preparation；optimization；in vitro evaluation；film dispersion method；single factor；orthogonal design

*通信作者：王曉娟（1962—），女，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，從事天然藥物化學(xué)與中藥新制劑研究。Tel：（029）84773189，E-mail：wxjyh231@fmmu.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：康玉霞（1989—），女，碩士生，從事中藥藥劑學(xué)研究。Tel：15709248232，E-mail：1039961519@qq.com

基金項(xiàng)目：陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研課題（15-ZY021）

收稿日期：2015-10-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.010

中圖分類號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1011-07