鄭芳昊， 羅佳波

（1.佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515）

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麻黃-桂枝藥對(duì)中桂枝對(duì)麻黃堿誘導(dǎo)興奮性變化的抑制作用

鄭芳昊1， 羅佳波2*

（1.佛山市中醫(yī)院，廣東佛山528000；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515）

摘要：目的 采用藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）模型擬合法考察麻黃-桂枝藥對(duì)配伍中桂枝對(duì)麻黃堿誘導(dǎo)的興奮性變化的抑制作用。方法 SD大鼠分別灌胃給予生理鹽水、麻黃堿、麻黃和麻黃-桂枝藥對(duì)（3∶2）水煎液。借助微透析采樣技術(shù)，以麻黃堿在腦脊液中的質(zhì)量濃度變化為PK觀察指標(biāo)，以氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)。結(jié)果 最佳藥效動(dòng)力學(xué)模型為Sigmoid-Emax模型。各組Glu的藥物濃度-效應(yīng)（E-C）曲線均呈順時(shí)針環(huán)，各組GABA的E-C曲線均呈逆時(shí)針環(huán)。結(jié)論 麻黃堿易于產(chǎn)生耐受性，桂枝可以抑制麻黃堿引起的興奮性變化。

關(guān)鍵詞：麻黃；桂枝；藥對(duì)；藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)（PK-PD）；谷氨酸（Glu）；γ-氨基丁酸（GABA）；藥物濃度-效應(yīng)（E-C）曲線；大鼠

麻黃湯是中醫(yī)治療風(fēng)寒表實(shí)證的經(jīng)典方劑，在臨床中應(yīng)用廣泛。其中，麻黃和桂枝是發(fā)揮藥效的主要藥味，在原方中的配伍比例為3∶2。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，麻黃-桂枝配伍可以增強(qiáng)藥物的發(fā)汗作用，緩解患者的發(fā)熱、鼻塞、咳喘等癥狀［1-5］。然而，由于麻黃堿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的毒副作用，西方國(guó)家將麻黃列為有毒的天然植物添加劑［6-10］。較低劑量下，麻黃可以改變大鼠的行為學(xué)參數(shù)，出現(xiàn)興奮性行為變化。而在較高劑量下，長(zhǎng)期給予麻黃將出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，提示長(zhǎng)期大劑量使用麻黃可能影響腦部特定區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和生理功能［11］。

PK-PD（pharmacokinetics-pharmacodynamics）模型（藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)結(jié)合模型），是在傳統(tǒng)藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的。通過(guò)測(cè)定特定效應(yīng)的藥物濃度和藥理效應(yīng)隨時(shí)間的變化，有助于了解兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。相對(duì)于傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)研究，PK-PD模型要求盡量了解藥物在體內(nèi)作用部位的動(dòng)力學(xué)特征，明確藥物在作用部位的濃度變化，以此與藥理效應(yīng)更緊密的聯(lián)系在一起，定量的反應(yīng)藥物濃度與效應(yīng)的關(guān)系。通常PK-PD模型可以通過(guò)特定的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，通過(guò)比較參數(shù)的變化進(jìn)一步掌握藥物在作用部位的綜合特性［12］。

本實(shí)驗(yàn)以麻黃堿在大鼠腦脊液中的質(zhì)量濃度變化為藥動(dòng)學(xué)觀察指標(biāo)（PK），以氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）的動(dòng)態(tài)變化為藥效學(xué)指標(biāo)（PD），闡明麻黃堿在大鼠額葉皮層的濃度-效應(yīng)-時(shí)間三維關(guān)系，擬合藥物濃度及其效應(yīng)經(jīng)時(shí)過(guò)程的曲線，為揭示麻黃-桂枝藥對(duì)配伍的減毒機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 麻黃為麻黃科植物草麻黃EPhedra sinica Stapf的干燥草質(zhì)莖，產(chǎn)地吉林，批號(hào)110901；桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presel的干燥嫩枝，產(chǎn)地廣西，批號(hào)121001，均購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室馬驥教授鑒定為正品。

1.2 試劑 鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)060307，赤峰艾克制藥科技有限公司）。乙腈、甲醇購(gòu)自德國(guó)默克公司，均為色譜純；氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀，均為市售分析純。

1.3 儀器與耗材 微透析系統(tǒng)（RWD302，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；探針（CMA20，瑞典CMA/Microdialysis AB公司）；高效液相色譜儀（Agilent1200 Series，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 6410 Triple Quad LC/MS，美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

1.4 動(dòng)物及分組 SD大鼠，雄性，24只，體質(zhì)量180～220 g，SPF級(jí)，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（粵）2011-0015。采用隨機(jī)方法將動(dòng)物分組，每組6只，分別灌胃給予生理鹽水、麻黃堿、麻黃和麻黃-桂枝藥對(duì)（3∶2）水煎液。

2 方法

2.1 藥液的制備

2.1.1 麻黃堿組 精密稱(chēng)取麻黃堿對(duì)照品，加蒸餾水制成4.80 mg/mL的溶液，作為麻黃堿組試液。

2.1.2 麻黃組 稱(chēng)取麻黃藥材，按麻黃湯原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。再煎30 min，定容。濃縮至1.50 g/mL，按麻黃堿計(jì)為4.80 mg/mL，作為麻黃組試液。

2.1.3 麻黃-桂枝（3∶2）組 稱(chēng)取麻黃藥材，按麻黃湯原方配比加10倍量水，浸泡30 min。煎煮20 min，去沫。按麻黃湯原方配比加桂枝藥材，煎煮30 min，定容。按麻黃量計(jì)濃縮至1.85 g/mL，按麻黃堿計(jì)為4.80 mg/mL，作為麻黃-桂枝（3∶2）組試液。

2.1.4 林格氏液的配制 分別稱(chēng)取4.300 0 g氯化鈉、0.122 1 g氯化鈣、0.149 0 g氯化鉀，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中，加稀鹽酸調(diào)pH 至7.4，定容，0.45 μL濾膜過(guò)濾，制得空白林格氏液溶液。

2.2 微透析法收集腦脊液 采用20％烏拉坦（0.6 mL/100 g）麻醉大鼠，插入胃管，固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨。參照《大鼠腦立體定位圖譜》，在前囟前2.6 mm、旁開(kāi)1.3 mm、硬膜下3.6 mm顱骨上鉆孔，插入腦探針。以1.5 μL/min灌注空白人工腦脊液（林格氏液），平衡2 h。分別灌胃給予各組試藥（1 mL/100 g），采用動(dòng)物低溫收集器收集透析液樣品，-80℃保存待測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌注，分離取出鼠腦，福爾馬林浸泡固定后，通過(guò)切片確定探針?biāo)谖恢檬欠駵?zhǔn)確。若腦內(nèi)損傷過(guò)重或探針膜頭彎曲，摒棄實(shí)驗(yàn)結(jié)果［13］。以1∶1比例混合待測(cè)透析液和內(nèi)標(biāo)溶液后，立即進(jìn)行LC-MS（液質(zhì)聯(lián)用）分析［14］。

2.3 PK-PD聯(lián)合模型分析 采用Winnonlin 4.0.1軟件，分別輸入時(shí)間、藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（藥物濃度隨時(shí)間的變化）、藥效動(dòng)力學(xué)指標(biāo)（Glu、GABA含有量隨時(shí)間的變化）3組數(shù)據(jù)，選用線性模型、對(duì)數(shù)模型及Sigmoid-Emax模型等PK-PD模型進(jìn)行擬合。根據(jù)軟件計(jì)算得到的R（相關(guān)系數(shù)）、AIC （Akaike信息量準(zhǔn)則）、SBC（Schwarz信息量準(zhǔn)則）等指標(biāo)選擇最佳藥效動(dòng)力學(xué)模型，比較不同給藥組間的參數(shù)差異。

3 結(jié)果

3.1 麻黃堿在額葉皮層部位的藥時(shí)曲線及Glu和GABA的水平變化 結(jié)果表明，不同組別麻黃堿在大鼠額葉皮層的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程基本一致。與生理鹽水組相比，不同組別的Glu、GABA均有不同程度的升高。其中，Glu均在60 min達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移逐漸下降；麻黃堿組GABA質(zhì)量濃度在100 min達(dá)到峰值，麻黃組和配伍組均在120 min達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移逐漸下降。見(jiàn)圖1～3。

圖1　麻黃堿藥-時(shí)曲線Fig.1 Concentration-time curves of ephedrine

圖2　Glu質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線Fig.2 Curves of Glu concentration w ith time

圖3　GABA質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線Fig.3 Curves of GABA concentration w ith time

3.2 PK-PD模型分析

3.2.1 不同PK-PD模型擬合的結(jié)果 如表1所示，通過(guò)PK-PD模型擬合，麻黃堿藥效指標(biāo)的最佳藥效動(dòng)力學(xué)（PD）模型為Sigmoid-Emax模型，各組AIC、SBC值相對(duì)較小，且相關(guān)系數(shù)較其它模型更接近1。其公式如下。

表1　藥對(duì)對(duì)麻黃堿PD模型擬合參數(shù)的影響Tab.1 Effects of herb pair on PD fitting parameters of ephedrine

其中，E為即時(shí)效應(yīng)值，Emax為最大效應(yīng)，E0為基礎(chǔ)效應(yīng)值，ECe50為引起效應(yīng)達(dá)到最大效應(yīng)一半時(shí)的藥物濃度值，C為藥物即時(shí)濃度值，S為形狀因子，反映曲線的形狀變化。

3.2.2 藥對(duì)配伍對(duì)Sigmoid-Emax模型擬合參數(shù)的影響 從表2的結(jié)果可以看出，麻黃堿組和麻黃組的Glu達(dá)峰質(zhì)量濃度（Emax）均大于配伍組，而ECe50值小于配伍組，說(shuō)明桂枝的加入抑制了麻黃堿引起的興奮性變化。各組GABA的S值均大于1，說(shuō)明此時(shí)S形曲線的中間部分較陡；而Glu的S值均小于1，說(shuō)明低質(zhì)量濃度時(shí)曲線較陡，但離開(kāi)ECe50后，其曲線較平坦，效應(yīng)接近Emax較慢。

3.2.3 PK-PD模型擬合的E-C曲線 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，以麻黃堿在大鼠腦脊液中的質(zhì)量濃度變化為PK指標(biāo)，以氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含有量的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)，各組Glu的E-C曲線均呈順時(shí)針環(huán)，說(shuō)明各組大鼠給予麻黃堿后均出現(xiàn)了顯著的快速耐受性；各組GABA的E-C曲線均呈逆時(shí)針環(huán)，說(shuō)明抑制性氨基酸含有量變化滯后于血藥濃度變化。

4 討論

傳統(tǒng)的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和藥效動(dòng)力學(xué)（PD）研究是分別進(jìn)行的。其中，藥代動(dòng)力學(xué)研究多是通過(guò)測(cè)定體內(nèi)血液的藥物濃度變化來(lái)反應(yīng)藥物在體內(nèi)的綜合作用特征，無(wú)法反應(yīng)作用部位的特定藥動(dòng)學(xué)特征。而藥效動(dòng)力學(xué)研究則主要在離體水平進(jìn)行，相關(guān)模型往往呈現(xiàn)藥物濃度和效應(yīng)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，無(wú)法反應(yīng)藥物在體內(nèi)的真實(shí)效應(yīng)變化。實(shí)際上，PK和PD是在體內(nèi)密切相關(guān)的兩個(gè)同時(shí)進(jìn)行的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。前者反應(yīng)藥物濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律，進(jìn)而可以推斷藥物的吸收、分布、代謝和排泄特征。后者描述藥理效應(yīng)隨時(shí)間的變化特征，進(jìn)而推斷作用部位的藥物濃度與藥理效應(yīng)之間的變化規(guī)律。因此，有必要將兩者結(jié)合起來(lái)同步研究。

麻黃堿是麻黃的主要藥效成分，同時(shí)也是麻黃產(chǎn)生興奮性毒副作用的毒性成分。由于麻黃堿分子量較小，因此可以直接通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦區(qū)。谷氨酸（Glu）是興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，而γ-氨基丁酸（GABA）是抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，兩者的含有量變化可以直接反應(yīng)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變化。有實(shí)驗(yàn)研究表明，麻黃堿可以引起大鼠腦部氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化，額葉皮層是影響最大的部位［15］。本實(shí)驗(yàn)采用的腦部微透析采樣技術(shù)，可以同時(shí)收集反應(yīng)藥物濃度變化和效應(yīng)變化的樣品，進(jìn)一步通過(guò)LC-MS/MS等靈敏度較高的分析技術(shù)可以測(cè)定樣品中微量的麻黃堿和Glu、GABA等效應(yīng)指標(biāo)。

目前，常用的PK-PD模型有線性模型、對(duì)數(shù)線性模型、最大效應(yīng)模型（Emax）、Sigmoid-Emax模型等。其中，Sigmoid-Emax模型是在研究中使用最多的藥效模型，適用于描述多種藥物在體內(nèi)的濃度和效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以麻黃堿在大鼠腦透析液中的質(zhì)量濃度變化為PK指標(biāo)，以氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含有量的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)，經(jīng)模型擬合比較符合Sigmoid-Emax模型。PK-PD模型的藥物濃度-效應(yīng)曲線（E-C曲線）大致可分為3種類(lèi)型，E-C S形曲線、E-C逆時(shí)針滯后曲線和E-C順時(shí)針曲線。本實(shí)驗(yàn)研究表明，以大鼠腦透析液中麻黃堿的質(zhì)量濃度變化為PK指標(biāo)，以Glu含有量的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)，給藥后各組E-C曲線均呈順時(shí)針，相對(duì)于藥物濃度上升期的效應(yīng)變化，同一藥物濃度在下降期內(nèi)所對(duì)應(yīng)的效應(yīng)顯著減弱，說(shuō)明各組動(dòng)物均對(duì)麻黃堿產(chǎn)生了快速耐受性。以大鼠腦透析液中麻黃堿的質(zhì)量濃度變化為PK指標(biāo)，以GABA含有量的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)，給藥后各組E-C曲線均呈逆時(shí)針，相對(duì)于達(dá)到藥物濃度峰值的時(shí)間，藥理效應(yīng)的峰值顯著滯后，表明引起GABA含有量變化的效應(yīng)室不在額葉皮層，麻黃堿并不是直接對(duì)GABA產(chǎn)生作用，而很有可能是機(jī)體對(duì)Glu含有量升高的自我調(diào)節(jié)作用。麻黃-桂枝配伍組與麻黃堿組和麻黃組相比，產(chǎn)生同一效應(yīng)值藥物濃度較高，說(shuō)明桂枝對(duì)中樞神經(jīng)的作用與麻黃堿相反，具有下調(diào)Glu水平和升高GABA水平的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PK-PD模型擬合，說(shuō)明以麻黃堿在大鼠腦透析液中的質(zhì)量濃度變化為PK指標(biāo)，以Glu、GABA含有量的動(dòng)態(tài)變化為PD指標(biāo)，最佳PK-PD模型為Sigmoid-Emax模型。E-C曲線表明麻黃堿易于產(chǎn)生耐受性，桂枝可以抑制麻黃堿引起的興奮性變化，這可能是麻黃-桂枝藥對(duì)配伍后相對(duì)安全的證明。

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［臨 床］

Neuroprotective effect of Cinnamomi Ramulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair

ZHENG Fang-hao1， LUO Jia-bo2*
（1.Foshan MuniciPal HosPital of Traditional ChineseMedicine，F(xiàn)oshan 528000，China；2.School of Traditional ChineseMedicine，Southern Medical U-niversity，Guangzhou 510515，China）

ABSTRACT：AIM To study the neuroprotective effect of CinnamomiRamulus against ephedrine-induced excitotoxicity in EPhedrae Herba-CinnamomiRamulus herb pair by pharmacokinetics-pharmacodynamics（PK-PD）modeling.METHODS SD rats received gavage with saline，ephedrine，ephedra and EPhedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pair（3∶2）decoctions.In themicrodialysis，the change of ephedrine concentration in cerebrospinal fluid was taken as a PK index，while the dynamic changes of amino acid neurotransmitterswere taken as PD indexes.RESULTS The best PK-PD modelwas Sigmoid-Emax.Each group of Glu E-C curve showed a clockwise loop，while E-C curve of GABA showed a counterclockwise loop.CONCLUSION Ephedrine has tachyphylaxis，and the excitatory changes induced by ephedrine can be inhibited by Cinnamomi Ramulus.

KEY WORDS：EPhedrae Herba；Cinnamomi Ramulus；herb pair；pharmacokinetics-pharmacodynamics（PKPD）；Glu；GABA；effect-concentration（E-C）curve；rats

*通信作者：羅佳波（1947—），男，教授，從事中藥新藥研發(fā)方向研究。Tel：（020）62789112，E-mail：ljb@fimmu.com

作者簡(jiǎn)介：鄭芳昊（1987—），男，博士，從事中藥新藥研發(fā)工作。Tel：（0757）81092010，E-mail：fanghao-zheng@foxmail.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（81030066）

收稿日期：2015-10-21

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.005

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-0984-05