楊柳曉， 高　強(qiáng)

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 上?！?00032 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科, 上海　200032

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·論著·

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的分離、純化及鑒定

楊柳曉1， 高強(qiáng)2*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 上海200032 2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科, 上海200032

[摘要]目的： 探討肝內(nèi)膽管癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(iCAFs)的分離、純化和鑒定方法，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法： 在無菌條件下，留取肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(iCCA)組織標(biāo)本，充分剪碎后置入含Ⅳ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶的消化液中恒溫振蕩，將所得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫磁珠分選純化，分離出腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)并培養(yǎng)。通過觀察細(xì)胞形態(tài)，并經(jīng)免疫熒光和流式細(xì)胞儀測定，鑒定其是否為iCAFs。結(jié)果： iCAFs呈長條形或紡錘形，胞質(zhì)透明，折光明顯，胞核單個(gè)、呈圓形或卵圓形, 細(xì)胞突起相互交錯(cuò)重疊形成網(wǎng)格狀排列、密集時(shí)呈現(xiàn) “峰-谷”樣表現(xiàn)；免疫熒光檢測顯示，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(+)、波形蛋白(+)、復(fù)合型角蛋白抗體(-)；流式細(xì)胞儀檢測示，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(+)，同時(shí)CD34和CD45均為(-)。結(jié)論： 酶消化法聯(lián)合免疫磁珠分選可有效分離出高純度的iCAFs，為進(jìn)一步研究iCAFs的相關(guān)功能研究提供了良好的平臺(tái)。

[關(guān)鍵詞]肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌；腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞；分離；鑒定

腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞被活化后可以通過自分泌和(或)旁分泌途徑為上皮提供促癌信號、參與腫瘤血管的形成，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[1]。這類具有特殊表型及功能、存在于腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞群即被稱為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)。研究[2]證實(shí)，CAFs的聚集和活化可以影響多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一種具有豐富間質(zhì)成分的原發(fā)性肝癌，其腫瘤間質(zhì)中富含的CAFs與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。為能進(jìn)一步研究iCCA相關(guān)成纖維細(xì)胞(iCAFS)的生物學(xué)特性和影響腫瘤的機(jī)制，原代iCAFs的分離純化和培養(yǎng)擴(kuò)增是必要的。目前國內(nèi)外對CAFs的分離主要采用組織塊貼壁法和酶消化法。本研究采用酶消化法聯(lián)合免疫磁珠分選進(jìn)行原代iCAFs的分離、純化及培養(yǎng)，證實(shí)具有可重復(fù)性及高純度獲得iCAFs的優(yōu)勢，有助于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1主要儀器及試劑Ⅳ型膠原酶購自美國Invitrogen公司、透明質(zhì)酸酶和牛血清蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、雙抗(青霉素、鏈霉素100 mg/L)、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)等購自美國Gibco公司；免疫組化及免疫熒光抗體α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、復(fù)合型角蛋白抗體(pan-CK)購自英國Abcam公司，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用α-SMA-FITC、CD34-PE和CD45-APC抗體購自美國R&D公司；免疫磁珠分選儀及anti-fibroblast MicroBeads試劑盒(130050601)購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司。

1.2標(biāo)本來源及采集用于原代分離的腫瘤標(biāo)本來自iCCA根治性切除的患者。在標(biāo)本手術(shù)切除離體后15 min內(nèi)，用無菌手術(shù)刀片切取體積大于1 cm3的組織塊，盡量選取活性好、典型的腫瘤區(qū)域，避開壞死、出血區(qū)域及血管，置于含DMEM+1%雙抗的50 mL離心管內(nèi)，于4℃條件轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。

1.3細(xì)胞分離及純化

1.3.1細(xì)胞酶消化法分離在超凈臺(tái)中，用含有雙抗的PBS液反復(fù)漂洗癌組織標(biāo)本多次，以去除血細(xì)胞；待沖洗液清亮后，用眼科剪修剪掉其他組織及肉眼可見的血管結(jié)構(gòu)；用無菌手術(shù)刀片及眼科剪機(jī)械法將組織塊盡量剪碎至<1 mm3，置于預(yù)先配制好的消化液(DMEM+0.1%BSA+1%雙抗+500 U/mL Ⅳ型膠原酶+100 U/mL透明質(zhì)酸酶，用0.22 μm孔徑一次性無菌抽濾器過濾除菌)中，注意將組織完全浸沒，于37℃恒溫振蕩儀內(nèi)振蕩30 min(200 次/min)。消化后經(jīng)過400目篩網(wǎng)過濾，將濾液離心(800×g, 5 min)以分離上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,棄去沉淀的細(xì)胞團(tuán)，將含有成纖維細(xì)胞的上清懸液再離心(100×g，10 min)，得到的沉淀細(xì)胞團(tuán)用DMEM反復(fù)漂洗2～3次，重懸再離心(300×g，10 min)后進(jìn)行免疫磁珠分選。

1.3.2細(xì)胞免疫磁珠分選純化將分離所得細(xì)胞計(jì)數(shù)后,以每107個(gè)重懸于80 μL分選緩沖液中，加入20 μL的anti-fibroblast磁珠抗體,充分混合后避光置于室溫(19～25℃)孵化30 min。用1～2 mL的分選緩沖液重懸后再離心(300×g，10 min)，所得細(xì)胞團(tuán)重懸于500 μL的分選緩沖液中，按照免疫磁珠分選說明書，使用免疫磁珠分選器及LS柱進(jìn)行陽性細(xì)胞的分選純化。純化后的細(xì)胞用培養(yǎng)液(DMEM+10%FBS+1%雙抗)重懸后置于25 mL培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.4細(xì)胞鑒定

1.4.1形態(tài)學(xué)觀察使用倒置相差顯微鏡每日觀察細(xì)胞的貼壁情況，貼壁后的生長狀況及形態(tài)變化。

1.4.2免疫熒光檢測將已消毒的24 mm×24 mm蓋玻片置于細(xì)胞培養(yǎng)六孔板的培養(yǎng)孔中，按1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔中進(jìn)行細(xì)胞爬片，2 d后進(jìn)行免疫熒光鑒定。除去培養(yǎng)液，用PBS(1 mL/孔)漂洗3次(每次5 min)；加入1 mL 4%多聚甲醛(用PBS配制)，室溫固定30 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入0.5% TritonX-100(用PBS配制)室溫孵育20 min，PBS洗3次(每次5 min)；加入5%山羊血清室溫封閉30 min，去除血清，加一抗(α-SMA、vimentin、pan-CK)，4℃過夜，PBS洗3次(每次5 min)；加熒光二抗(1∶1 000)室溫反應(yīng)30 min，PBS洗3次(每次5 min)；DIPA染核，加熒光封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3流式細(xì)胞儀檢測將分離培養(yǎng)的細(xì)胞制備成1×106個(gè)/mL的懸液，加入1 mL破膜固定液于4℃遮光孵育30～60 min，離心重懸，經(jīng)BSA封閉后加入流式抗體(α-SMA-FITC、CD34-PE、CD45-APC及同型對照)混勻，于4℃冰箱孵育20～30 min后，混勻離心棄上清，重懸后上機(jī)檢測。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)及傳代將分離的細(xì)胞接種于25 mL培養(yǎng)瓶1～2 h后即可見貼壁，初始貼壁細(xì)胞常為圓形；24～48 h后逐漸伸展成長條形，胞膜同時(shí)形成多個(gè)大小不一的突起，胞質(zhì)透明，折光明顯，胞核單個(gè)、呈圓形或卵圓形(圖1A)；此后這些突起不斷向周邊延伸擴(kuò)展，并相互交錯(cuò)重疊形成網(wǎng)格狀排列(圖1B)；當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)，顯微鏡下呈現(xiàn)典型的“峰-谷”樣表現(xiàn)(圖1C)。初代培養(yǎng)需每2～3 d更換培養(yǎng)液，通常經(jīng)過1周左右即可傳代；第3代以后細(xì)胞增殖迅速，3～4 d即可傳代。細(xì)胞所能傳的代數(shù)受供體個(gè)體差異影響較大。

圖1　顯微鏡下iCAFs的形態(tài)A：生長第2天的iCAFs(100×)；B： 生長第10天的iCAFs (100×)；C：生長第10天的iCAFs (40×)

2.2細(xì)胞免疫熒光染色特點(diǎn)將分離的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，由圖2可見，細(xì)胞形態(tài)如前所述，pan-CK染色陰性，排除其上皮來源的可能性；而α-SMA和vimentin染色強(qiáng)陽性，高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)條索狀纖維組織染色均勻，胞核清晰完整。Vimentin染色陽性通常提示細(xì)胞來源于間葉組織，而α-SMA是CAFs的特征性標(biāo)志物。

2.3流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果用流式細(xì)胞儀檢測分離培養(yǎng)的細(xì)胞α-SMA、 CD34、 CD45的表達(dá)情況。細(xì)胞主要表現(xiàn)為α-SMA(+)、同時(shí)CD34(-)和CD45(-)的特征。以同型對照為參照，α-SMA陽性表達(dá)的細(xì)胞達(dá)99.1%，提示其成纖維細(xì)胞的特征；而CD34和CD45基本不表達(dá)，證明其不是來源于內(nèi)皮和(或)髓源性細(xì)胞系(圖3)。

圖2　iCAFs免疫熒光染色的結(jié)果

圖3　iCAFs流式細(xì)胞檢測結(jié)果A：設(shè)門圈定檢測的iCAFs細(xì)胞，F(xiàn)SC為前向角度散射，SSC為側(cè)向角散射；B：iCAFs表現(xiàn)為α-SMA(+)CD45(-)；C：iCAFs表現(xiàn)為α-SMA(+)CD34(-)

3討論

3.1CAFs分離純化的方法CAFs是腫瘤微環(huán)境重要的組成成分之一，其與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用可以影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。一般認(rèn)為，CAFs具有促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力[2]。但由于其來源及構(gòu)成的多樣性，目前也有研究者認(rèn)為其功能存在異質(zhì)性，甚至具有抑制腫瘤的作用[4-6]。而針對iCAFs的研究也正從功能研究深入至iCCA靶點(diǎn)治療等方面[7]。為進(jìn)一步了解iCAFs影響腫瘤的作用機(jī)制，原代iCAFs的分離純化和培養(yǎng)擴(kuò)增是必要的。

目前，常見的CAFs的原代分離方法有組織塊貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法是將腫瘤組織剪碎成小塊狀，貼于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁上，加入適量培養(yǎng)基，待細(xì)胞從組織塊邊緣慢慢爬出。此方法簡便易行，無需特殊的試劑和材料，便于推廣。但也存在如下缺點(diǎn)[8]：(1)周期長，細(xì)胞從組織塊邊緣爬出一般需要10～15 d，同時(shí)剛爬出的細(xì)胞擴(kuò)增能力差，3～4周左右才能長滿瓶底；(2)純度差，在細(xì)胞爬出過程中，會(huì)摻雜有其他種類細(xì)胞；(3)效率低，成功率僅約60%。

酶消化法是將腫瘤組織碾碎后，添加各種消化酶，經(jīng)過振蕩消化，將細(xì)胞從組織中分離出來形成單細(xì)胞懸液，再進(jìn)行過濾、離心、接種的方法。此方法相較于組織塊貼壁法具有周期短、重復(fù)性強(qiáng)、效率高等優(yōu)勢。目前使用較多的消化酶包括胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的組織，對于iCCA這類組織內(nèi)間質(zhì)豐富的腫瘤，胰蛋白酶的消化效率則大大下降。本研究借鑒Mazzocca等[9]分離肝細(xì)胞肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，采用Ⅳ型膠原酶、透明質(zhì)酸酶及BSA制備的消化液,對細(xì)胞恒溫震蕩消化，可以快速從腫瘤組織中分離出大量單細(xì)胞，且能更大程度保證細(xì)胞的活性。

在體外培養(yǎng)原代細(xì)胞時(shí)，通常需要實(shí)驗(yàn)的一致性和可重復(fù)性，這樣才能保證這一細(xì)胞生物學(xué)特性研究結(jié)果的可靠性，因而細(xì)胞的純化就成為原代細(xì)胞分離培養(yǎng)中關(guān)鍵的一步。無論是組織貼壁法還是酶消化法，所得的原代細(xì)胞中通?；祀s有其他類型的細(xì)胞，因此在后續(xù)的培養(yǎng)傳代中還需要通過自然純化法、時(shí)間差酶消化法、機(jī)械刮除或反復(fù)貼壁等方法來進(jìn)一步純化[10]。這些方法大多需要經(jīng)過多次傳代，而代次的增加會(huì)影響原代細(xì)胞的生物學(xué)特性。本研究將酶消化法所得的單細(xì)胞懸液通過梯度離心去除大部分上皮細(xì)胞后，再進(jìn)行免疫磁珠分選，用anti-fibroblast的磁珠抗體和LS柱陽性分選CAFs，所得細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，顯示其純度達(dá)99.1%。免疫磁珠分選可以迅速純化細(xì)胞，縮短整個(gè)原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的時(shí)間，其缺點(diǎn)為：免疫磁珠抗體費(fèi)用昂貴，且分選過程可能造成部分原代細(xì)胞的裂解或活力下降。

3.2iCAFs分離培養(yǎng)的關(guān)鍵問題原代iCAFs在分離培養(yǎng)過程中除需要注意無菌等原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)的一般問題外，還要注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問題。(1)腫瘤組織的取材和運(yùn)輸：在腫瘤組織標(biāo)本離體后應(yīng)即刻取材，以免細(xì)胞的活性降低；切取的組織于冰上運(yùn)輸以保證組織新鮮。(2)組織塊的剪切：所取的腫瘤組織盡量剪碎成肉糜狀，以利于組織表面與消化液充分接觸，縮短消化時(shí)間。(3)選擇合適的消化酶：以往的報(bào)道顯示乳腺癌、口腔癌等CAFs的原代分離通常用胰蛋白酶或Ⅰ型膠原酶[11-12]，但iCCA較這些腫瘤含有更多的間質(zhì)成分。因此，本研究配置了含DMEM、0.1%BSA、1%雙抗、500 U/mL Ⅳ型膠原酶、100 U/mL透明質(zhì)酸酶的消化液。其中Ⅳ型膠原酶包含至少7種蛋白酶，可以消化多種組織；透明質(zhì)酸酶可以降低細(xì)胞間質(zhì)的黏性，利于單個(gè)細(xì)胞的析出；而BSA可以提高細(xì)胞消化過程中所需的營養(yǎng)。(4)恰當(dāng)?shù)南瘯r(shí)間：不同的腫瘤組織在不同的消化液濃度下所需要的消化時(shí)間也不同。本研究早期根據(jù)國外研究[8]的經(jīng)驗(yàn)消化16 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均死亡，無法貼壁生長。而消化時(shí)間太短又無法獲得足夠量的單細(xì)胞。通過不斷摸索，本研究確定于37℃恒溫箱內(nèi)以200 次/min持續(xù)震蕩消化30～45 min基本可以獲得滿意的單細(xì)胞懸液。具體的消化時(shí)間根據(jù)需消化的組織量來決定。(5)免疫磁珠分選時(shí)注意動(dòng)作輕柔，以避免細(xì)胞因發(fā)生機(jī)械性擠壓而破裂、死亡。

綜上所述，采用Ⅳ型膠原酶加透明質(zhì)酸酶消化法聯(lián)合免疫磁珠分選原代iCAFs，具有可重復(fù)性及高純度獲得的優(yōu)勢，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了良好的平臺(tái)。

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[本文編輯]姬靜芳

Isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma associated fibroblasts

YANG Liu-xiao1, GAO Qiang2*

1.Department of Intensive Care Unit, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Hepatic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

[Abstract]Objective： To explore the methods of isolation, purification, and identification of intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA) associated fibroblasts (iCAFs), which could facilitate further functional and pharmacological evaluation.Methods： Under aseptic conditions the tissue specimens of iCCA were obtained, minced, and digested in the digestive medium supplemented with collagenase Ⅳ and hyaluronidase. The single-cell suspension underwent immunomagnetic separation and purification, and carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) were separated and cultured. Through morphological observation, immunofluorescent staining and flow cytometry analysis, whether the cells were iCAFs or not.Results： Morphologically, iCAFs were elongated or fusiform, with transparent cytoplasm, obvious refraction, single round or ovoid nucleus. Cellular processes overlap to form grids and show the "peak-valley" pattern. Under immunofluorescence, the typical iCAFs showed positive staining for alpha smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin, and negative staining for pan-cytokeratin. Under flow cytometry detection, they were positive for α-SMA and negative for both CD34 and CD45.Conclusions： Enzyme digestion in combination with immunomagnetic separation can effectively separate iCAFs with high purity, providing a good platform for further studies on the roles of iCAFs in the pathogenesis of iCCA.

[Key Words]intrahepatic cholangiocarcinoma; carcinoma-associated fibroblasts; isolation; identification

[中圖分類號]R 735.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡介]楊柳曉，博士，主治醫(yī)師. E-mail: yang.liuxiao@zs-hospital.sh.cn*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: gao.qiang@zs-hospital.sh.cn

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81372648, 81502028). Supported by National Natural Science Foundation of China(81372648, 81502028).

[收稿日期]2016-01-22[接受日期]2016-02-25