劉振峰，劉新梅，方　銳，艾力江·阿斯拉，鄧迎杰，宋玉成

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

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買朱尼對骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用研究

劉振峰，劉新梅，方銳，艾力江·阿斯拉，鄧迎杰，宋玉成

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

[摘要]目的觀察維藥買朱尼對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，探討買朱尼對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和買朱尼組，每組10只。模型組和買朱尼組采用改良Hulth造模法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型，建模第2周開始買朱尼組灌胃買朱尼10.31 mg/(kg·d)，模型組和假手術(shù)組灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)4周。末次灌胃后24 h取3組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本進(jìn)行大體評分和組織學(xué)評分，采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測Wnt/β-catenin通路中β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a的表達(dá)水平。結(jié)果模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本大體評分、軟骨組織學(xué)Mankin評分及軟骨細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，而買朱尼組均明顯低于模型組(P均<0.05)。結(jié)論維藥買朱尼可以減輕大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的程度，其可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用。

[關(guān)鍵詞]骨性關(guān)節(jié)炎；維藥買朱尼；Wnt/β-catenin通路

骨性關(guān)節(jié)炎是一種多發(fā)于老年人的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性和退行性病變?yōu)橹饕卣?，?yán)重影響患者下肢運(yùn)動功能及生活質(zhì)量[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多條信號通路，其中Wnt/β-catenin通路在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[2]。Wnt信號通路在多種生理/病理過程中發(fā)揮作用，包括生物體的生長、發(fā)育、疾病、衰老等，也包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、免疫等[3-5]。維藥買朱尼是二級干熱蜜膏制劑，具有補(bǔ)益腦腎、緩解疼痛、活血、燥濕等作用，適用于外來寒邪因素引發(fā)的非體液型寒性氣質(zhì)失調(diào)疾病。買朱尼中主要成分西紅花有強(qiáng)健筋骨、醒神益智、暖體通阻的功效，對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎有顯著的治療效果[6]。本實驗通過構(gòu)建骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，研究了維藥買朱尼對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用，旨在從分子水平探討買朱尼對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

1實驗資料

1.1藥物維藥買朱尼成分包括巴旦杏仁、阿月渾子、肉豆蔻、胡椒、姜/桂皮、坷子皮、毛坷子、余甘子、歐白芨各15 g，蜂蜜2倍量，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院提供。

1.2實驗動物雄性健康清潔級SD大鼠30只，鼠齡2個月，體質(zhì)量(250±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(新)2013-0032。復(fù)合飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為60%。實驗過程中對動物處置符合動物實驗倫理學(xué)要求。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組、模型構(gòu)建及藥物處理將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和買朱尼組，每組10只。采用改良Hulth造模法[7]建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型：將大鼠麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺上，無菌條件下取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長約2 cm，顯露膝關(guān)節(jié)，然后切斷前后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后不固定傷肢，自由活動，可適當(dāng)給予抗生素預(yù)防感染。手術(shù)7 d后驅(qū)趕動物，每日30 min，分2次驅(qū)趕，驅(qū)趕4周后即得明顯的骨性關(guān)節(jié)炎模型。買朱尼組從建模第2周開始灌胃買朱尼，根據(jù)人鼠體質(zhì)量換算出服藥量為10.31 mg/(kg·d)[8]，假手術(shù)組和模型組均灌胃等量生理鹽水，均持續(xù)4周。

1.3.2標(biāo)本大體觀察末次灌胃后24 h采用CO2安樂死法處死大鼠[9]，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨并根據(jù)文獻(xiàn)[10]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：0分，關(guān)節(jié)面光滑；1分，關(guān)節(jié)面粗糙；2分，關(guān)節(jié)面糜爛；3分，關(guān)節(jié)面潰瘍；4分，軟骨剝脫。

1.3.3軟骨組織學(xué)評分固定股骨內(nèi)側(cè)髁，放入硝酸進(jìn)行脫鈣，用刀片取軟骨組織，并經(jīng)乙醇、二甲苯脫水至透明，石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察并對標(biāo)本進(jìn)行改良Mankin評分[11]。

1.3.4軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a mRNA表達(dá)檢測將大鼠軟骨組織加入1 mL TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：2 μg RNA,1 μL 0.5 μg/μL Oligo(dT)Primer (Promega Corp),1 μL 10 mmol/L dNTP Mix,5 μL M-MLV 5X Reaction Buffer和1 μL 200 IU/μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(終體積25 μL)。使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’ ACCATTCGGCTAAACGGTC，下游引物：5’- CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β-5上游引物：5’- GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’；GAPDH上游引物：5’-TGCTGAGTATGTTTCTTGCC-3’，下游引物：5’-GTCTTCTGAGTGGGCAT-3’。Real time PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.3.5軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a 蛋白表達(dá)檢測采用Western blot 法檢測。 剝離大鼠軟骨組織，抽提細(xì)胞總蛋白，BCA方法進(jìn)行蛋白濃度鑒定。各取20 μL樣品(含10 μg總蛋白)進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，與封閉液室溫孵育2 h后分別與兔抗鼠β-catenin、Wnt-3a、GSK-3β、GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，羊抗兔多克隆二抗IgG(1∶5 000)37 ℃孵育1 h。用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，NE，USA)檢測蛋白信號，采用軟件Odyssey system application進(jìn)行蛋白表達(dá)定量分析，GAPDH作為內(nèi)參。所有使用抗體均購自美國Santa cruz公司。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，大體評分采用秩和檢驗，其余檢測采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本大體評分情況模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本大體評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，買朱尼組大鼠軟骨標(biāo)本大體評分明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本大體評分情況　　只

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評分假手術(shù)組改良Mankin評分為(0.56±0.35)分，模型組為(2.86±1.27)分，買朱尼組為(1.37±1.01)分。模型組改良Mankin評分明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，買朱尼組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達(dá)水平模型組中軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，買朱尼組β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a mRNA表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β和

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.4各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達(dá)水平模型組中軟骨細(xì)胞β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達(dá)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，買朱尼組β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a蛋白表達(dá)水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖1及表3。

3討論

骨性關(guān)節(jié)炎是一種退行性病變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、丟失、纖維化、潰瘍及骨贅形成，可以繼發(fā)于畸形性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等影響關(guān)節(jié)軟骨或造成關(guān)節(jié)負(fù)重不平衡的骨關(guān)節(jié)疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。在全球逐步進(jìn)入老齡化社會的背景下，骨性關(guān)節(jié)炎因其患病率高、危害性大，已成為備受關(guān)注的、十分嚴(yán)重的公共健康問題。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路對細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等具有調(diào)節(jié)作用，并參與骨代謝相關(guān)疾病的發(fā)病過程[12-14]。為證明Wnt信號在軟骨細(xì)胞基質(zhì)分解代謝中的作用，Yuasa等[15]采用Wnt-3a刺激兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶3和金屬蛋白酶13的表達(dá)增強(qiáng)，并且促進(jìn)了IL-1β引起的蛋白多糖基質(zhì)丟失。Blom等[16]發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt-16和Wnt2β的表達(dá)水平顯著上升，并進(jìn)一步誘導(dǎo)關(guān)節(jié)組織中MMPs和聚蛋白多糖酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷。Wnt通路中關(guān)鍵分子包括β-catenin、GSK-3β和Wnt-3a，其中β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心分子，上游分子傳遞的信號均需通過β-catenin才能發(fā)揮作用。Corr[17]在退變的軟骨細(xì)胞內(nèi)觀察到β-catenin表達(dá)顯著增加，從而推斷Wnt信號通路的激活與軟骨丟失有關(guān)。Johlrson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)明顯上升，其過度表達(dá)在骨性關(guān)節(jié)炎形成中起重要作用。GSK-3β是軸蛋白(Axin)的關(guān)鍵組成部分，通過磷酸化β-catenin 使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin維持低水平[19]。

圖1　各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞β-catenin、

組別nβ-cateninGSK-3βWnt-3a假手術(shù)組101.051±0.2351.003±0.4850.969±0.236模型組103.792±0.861①2.692±1.035①2.681±1.264①買朱尼組101.458±0.658②1.364±0.482②1.956±0.529②

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

近年來許多學(xué)者開展了中藥復(fù)方及提取物對Wnt信號通路干預(yù)的相關(guān)研究，并取得了一些進(jìn)展。二級干熱蜜膏制劑買朱尼具有緩解疼痛、開通阻滯、強(qiáng)筋健骨、燥濕、活血等功效，其可以調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶1/13及其組織抑制因子Ⅰ、Ⅱ型膠原的表達(dá)，對骨性關(guān)節(jié)炎有潛在的治療價值[20-21]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，維藥買朱尼可以顯著降低軟骨大體評分及 Mankin評分，降低軟骨細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt-3a的mRNA和蛋白表達(dá)水平。提示買朱尼可以減輕大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的程度，其可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路來發(fā)揮保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Buckwalter JA,Anderson DD,Brown TD,et al. The Roles of Mechanical Stresses in the Pathogenesis of Osteoarthritis:Implications for Treatment of Joint Injuries[J]. Cartilage,2013,4(4):286-294

[2]Abed é,Couchourel D,Delalandre A,et al. Low sirtuin 1 levels in human osteoarthritis subchondral osteoblasts lead to abnormal sclerostin expression which decreases Wnt/beta-catenin activity[J]. Bone,2014,59:28-36

[3]Chen H,Wang S,Chen L,et al. MicroRNA-344 inhibits 3T3-L1 cell differentiation via targeting GSK3beta of Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Febs Lett,2014,588(3):429-435

[4]Sastre-Perona A,Santisteban P. Wnt-independent role of beta-catenin in thyroid cell proliferation and differentiation[J]. Mol Endocrinol,2014,28(5):681-695

[5]Zhang R,Oyajobi BO,Harris SE,et al. Wnt/beta-catenin signaling activates bone morphogenetic protein 2 expression in osteoblasts[J]. Bone,2013,52(1):145-156

[6]孟慶才，方銳，王永軍，等. 維藥買朱尼對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中Fas及FasL mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2006,10(35):33

[7]Rogart JN,Barrach HJ,Chichester CO. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage,1999,7(6):539-547

[8]Felson DT,Zhang Y. An update on the epidemiology of knee and hip osteoarthritis with a view to prevention[J]. Arthritis Rheum，1998，41(8):1343-1355

[9]Artwohl J,Brown P,Corning B,et al. Report of the ACLAM Task Force on Rodent Euthanasia[J]. J Am Assoc Lab Anim Sci,2006,45(1):98-105

[10] Pelletier JP,Jovanovic D,Fernandes JC,et al. Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase[J]. Arthritis Rheum,1998,41(7):1275-1286

[11] Mankin HJ,Dorfman H,Lippiello L,et al. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data[J]. J Bone Joint Surg Am,1971,53(3):523-537

[12] He F,Xiong W,Wang Y,et al. Epithelial Wnt/beta-catenin signaling regulates palatal shelf fusion through regulation of Tgfbeta3 expression[J]. Dev Biol，2011，350(2): 511-519

[13] Tsai SY,Sennett R,Rezza A,et al. Wnt/beta-catenin signaling in dermal condensates is required for hair follicle formation[J]. Dev Biol,2014,385(12):179-188

[14] Zhu S,Liu H,Wu Y,et al. Wnt and Rho GTPase signaling in osteoarthritis development and intervention:implications for diagnosis and therapy[J]. Arthritis Res Ther,2013,15(2):217-225

[15] Yuasa TD,Otanit GA,Koiket O,et al. Wnt/beta-catenin signaling stimulates matrix catabolic genes and activity in articular chondrocytes:its possible role in joint degeneration[J]. Lab Invest,2008,88(3):264-274

[16] Blom AB,Brockband SM,Vanlent PL,et al. Involvement of the Wnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis：prominent role of Wnt-induced signaling protein 1[J]. Arthritis Rheum,2009,60(2):501-512

[17] Corr M. Wnt-beta-catenin signaling in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. Nat Clin Pract Rheumatol,2008,4(10):550-556

[18] Johlrson ML,Kamel MA. The Wnt signaling pathway and hone metabolism[J]. Curt Opin Rheumatol,2007,19(4):376-382

[19] Ju C,Li Y,Semenov M,et al. Control of beta-catenin phosphorylation/ degradation by a dual kinase mechanism[J]. Cell,2002,108(6):837-847

[20] 方銳,劉振鋒,艾力江o阿斯拉. 維藥買朱尼含藥血清影響大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶1及其組織抑制因子1的表達(dá)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(50):9327-9331

[21] 張耀武,方銳,劉振峰,等. 維藥買朱尼對骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的影響[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(52):9696-9700

Effects of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models

LIU Zhenfeng, LIU Xinmei, FANG Rui, AI Lijiang·Asila, DENG Yingjie, SONG Yucheng

(Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi 830000, Xinjiang, China)

Abstract:Objective It is to study the regulatory function of Uygur medicine Maizhuni on Wnt/β-catenin pathway in rat osteoarthritis models. Methods Knee osteoarthritis model was constructed using modified Hulth method. 30 healthy SD rats were randomly divided into sham group, model group and Maizhuni group with 10 rats in each group. From the second week, rats were administered with Uygur medicine Maizhuni (10.31 mg/(kg·d)) or saline by gavage for 4 weeks. General scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage in the three groups were evaluated. Quantitative real-time PCR and Western blotting were used to determine the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3a in the Wnt/β-catenin pathway. Results Compared to the sham group, the general scores and Mankin scores of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was significantly increased. Compared to the model group, the degree of rat knee joint cartilage degeneration in Maizhuni group was obviously alleviated. The cartilage general score and Mankin score in Maizhuni group was lower than that in the model group (P<0.05). On the molecular lever, we found that Maizhuni treatment significantly reduced the expression of β-catenin, GSK-3β and Wnt-3 in the knee joint chondrocytes (P<0.05). Conclusion Uygur medicine Maizhuni could protect the articular cartilage by regulation of Wnt/β-catenin pathway.

Keywords:osteoarthritis, Uygur medicine Maizhuni, Wnt/β-catenin pathway

[收稿日期]2015-07-01

[中圖分類號]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)07-0690-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.07.002

[基金項目]新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程(2013721040)

[作者簡介]劉振峰，男，碩士，主治醫(yī)師，助理研究員，主要從事骨代謝性疾病的研究。[通信作者]方銳，E-mail：85681924@qq.com