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        高效液相色譜法同時(shí)測定山柰中槲皮素和山柰素含量

        2016-05-30 12:11:50封傳華李剛張靜徐蘭陶曉璇
        中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年6期
        關(guān)鍵詞:高效液相色譜法槲皮素

        封傳華 李剛 張靜 徐蘭 陶曉璇

        摘要:目的 建立高效液相色譜法測定山柰藥材中槲皮素和山柰素的含量。方法 采用ODS2 C18(5 μm, 4.6 mm×150 mm)色譜柱,以甲醇-0.4%磷酸(47∶53)為流動(dòng)相,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長為367 nm,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 槲皮素在0.016 5~1.65 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 7),平均回收率為96.8%,RSD=2.02%;山柰素在0.014 6~1.46 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 5),平均回收率為97.3%,RSD=1.77%。結(jié)論 該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性較好,可用于山柰藥材中槲皮素和山柰素的含量測定。

        關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;山柰;槲皮素;山柰素

        DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.020

        中圖分類號:R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)06-0077-03

        Abstract: Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L.. Methods ODS2 C18 (5 μm, 4.6 mm×150 mm) was used as chromatographic column; methanol-0.4% phosphate (47:53) was the mobile phase; the flow rate was 1 mL/min; column temperature was 30 ℃; the detection wavelength was 367 nm; the injection volume was 10 μL. Results Quercetin showed good linear relationship in the range of 0.016 5–1.65 μg (r=0.999 7). The average recovery rate was 96.8%, RSD=2.02%; kaempferol showed good linear relationship in the range of 0.014 6–1.46 μg (r=0.999 5). The average recovery rate was 97.3%, RSD=1.77%. Conclusion The method is simple, accurate, and with good reproducibility, which can be used for content determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L..

        Key words: HPLC; Kaempferia galanga L.; quercetin; kaempferol

        山柰為姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根莖,主產(chǎn)于云南、廣東、廣西等地區(qū),具有溫中散寒、行氣止痛等功效,臨床主要用于治療胸膈脹滿、脘腹冷痛、飲食不消、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。近年來有關(guān)山柰的研究主要集中在山柰揮發(fā)油的提取、化學(xué)成分分析、生物活性等方面,而山柰中槲皮素、山柰素等黃酮類成分的報(bào)道較少[1-3],筆者采用高效液相色譜法(HPLC)對山柰藥材中的槲皮素、山柰素的含量進(jìn)行測定,為控制藥材質(zhì)量、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等提供參考。

        1 儀器與試藥

        島津高效液相色譜儀(包括CTO柱溫箱,SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器,LC-15C泵,SPD-15C紫外檢測器)。AUW-120D型分析天平(島津公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠),KQ3200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),DFT-50手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

        山柰素(中國食品藥品檢定研究院,批號110861- 201310);槲皮素(中國食品藥品檢定所研究院,批號110754-201308);甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號20140318);磷酸(南昌鑫光精細(xì)化工廠,分析純);山柰藥材購自江西敦壽堂國藥有限公司,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)褚小蘭教授鑒定為姜科植物山柰Kaempferia galanga L.;水為超純水;其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:迪馬ODS2 C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.4%磷酸(47∶53);流速:1 mL/min;檢測波長:367 nm;柱溫:30 ℃。理論板數(shù)按山柰素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

        2.2 混合對照品溶液的制備

        取槲皮素、山柰素對照品適量,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加適量甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,得濃度分別為0.165、0.146 mg/mL的混合對照品溶液,備用。

        2.3 供試品溶液的制備

        取山柰藥材適量,烘干、粉碎、過篩,取粉末(過65目)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25 mL甲醇,精密稱定,超聲提取(功率300 W,頻率50 kHz)30 min,放冷,再精密稱定,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,過濾,精密量取續(xù)濾液15 mL置于燒瓶中,加鹽酸溶液(15→37)5 mL,搖勻,置水浴中加熱水解30 min,取出,置于冷水中迅速冷卻,轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得[4]。

        2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋并定容至刻度,搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定槲皮素和山柰素峰面積。以槲皮素、山柰素濃度對其峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:槲皮素Y=7E+0.6X-48 953,r=0.999 7;山柰素Y=7E+0.4X-49 731,r=0.999 5。結(jié)果表明,槲皮素在0.016 5~1.65 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,山柰素在0.014 6~1.46 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

        2.5 精密度試驗(yàn)

        精密吸取供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣量10 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算峰面積,結(jié)果槲皮素峰面積RSD=1.89%,山柰素峰面積RSD=1.56%。表明精密度良好,符合含量測定的基本要求。

        2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取供試品溶液,于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,按2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算得槲皮素峰面積RSD=1.96%,山柰素峰面積RSD=2.14%,結(jié)果表明,山柰素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

        2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

        取同一批山柰藥材粉末(過65目),按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品,分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,按2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算得槲皮素峰面積RSD=1.48%,山柰素峰面積RSD=1.29%。結(jié)果表明,本方法測定山柰中山柰素的含量,重復(fù)性較好。

        2.8 加樣回收率試驗(yàn)

        取同一批已知槲皮素及山柰素含量的山柰藥材粉末(過65目)6份,每份約0.2 g,精密稱定,分別加入混合對照品溶液適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制備溶液,分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1、表2。

        2.9 樣品含量測定

        根據(jù)已建立的含量測定方法,取3批山柰藥材粉末(過65目),每批3份,稱取適量,按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定其峰面積,分別代入線性回歸方程,計(jì)算山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量,結(jié)果3批樣品中槲皮素含量分別為0.082%、0.086%、0.079%,山柰素含量分別為0.066%、0.058%、0.063%,見表3。色譜圖見圖1。

        3 討論

        山柰除含有揮發(fā)油外,還有大量黃酮類化合物,如槲皮素、山柰素等,槲皮素具有清除氧自由基、抗過敏、抗菌、抗病毒、降血糖、防癌治癌等藥理活性,山柰素則具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)兗耙种艸IV蛋白酶活性等藥效??梢?,山柰是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ闹兴幉?,?010年版《中華人民共和國藥典》僅對山柰中揮發(fā)油的含量有規(guī)定,而未對槲皮素、山柰素等黃酮類成分含量進(jìn)行規(guī)定,相關(guān)研究報(bào)道亦較少,故建立HPLC同時(shí)測定山柰藥材中槲皮素、山柰素等黃酮類含量的方法,對于藥材質(zhì)量控制、合理選用藥材等具有較大的借鑒意義[5-6]。

        筆者考察了加熱回流提取法和超聲提取法的提取效果,結(jié)果顯示,2種方法所得提取物中槲皮素、山柰素含量未出現(xiàn)明顯的差異,但加熱回流法的出膏率較超聲提取法明顯增加,HPLC圖雜質(zhì)峰略有增加,影響槲皮素、山柰素的分離,故采用超聲提取法用于山柰中槲皮素、山柰素的提取。同時(shí)對提取時(shí)間進(jìn)行了考察,分別比較了15、30、45、60 min的提取效果,結(jié)果顯示,槲皮素、山柰素在30 min內(nèi)基本提取完全,時(shí)間進(jìn)一步延長,二者的含量未出現(xiàn)顯著提高,故含量測定時(shí)采用超聲提取30 min即可。

        文獻(xiàn)報(bào)道,山柰藥材中槲皮素、山柰素等成分是以苷類的形式存在,提取物中僅含有少量的槲皮素、山柰素,不能較為客觀地反映其真實(shí)含量[7],故測定山柰藥材中的槲皮素、山柰素時(shí),需對提取物進(jìn)行水解。筆者參考2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)紅花中山柰素含量測定的樣品處理方法,于提取物中加入適量稀鹽酸,水浴中加熱水解30 min即可[8-9]。試驗(yàn)采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相,為了得到較好的分離效果,對流動(dòng)相的比例進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示,當(dāng)甲醇與0.4%磷酸溶液的比例為47∶53時(shí),槲皮素、山柰素的出峰時(shí)間適中,分離度及峰形均比較好,可用于山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量測定。

        結(jié)果表明,本研究所建立的方法具有專屬性強(qiáng)、回收率高、重復(fù)性好等特點(diǎn),可快速、準(zhǔn)確地測定山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量,對于評價(jià)藥材的質(zhì)量具有較大的參考價(jià)值。

        參考文獻(xiàn):

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        [3] 杜小偉,王京輝,肖斯婷,等.高效液相色譜法測定不同來源羅布麻葉中槲皮素和山柰素的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2013,20(1):51- 53.

        [4] 梁選革,張若燕,劉莉麗.紅花注射液中槲皮素和山柰素含量的同效液相色譜測定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2012,23(10):2475-2477.

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        (收稿日期:2015-09-16)

        (修回日期:2015-09-28;編輯:陳靜)

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