封傳華 李剛 張靜 徐蘭 陶曉璇

摘要：目的 建立高效液相色譜法測定山柰藥材中槲皮素和山柰素的含量。方法 采用ODS2 C18（5 μm， 4.6 mm×150 mm）色譜柱，以甲醇-0.4%磷酸（47∶53）為流動相，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為367 nm，進樣量為10 μL。結(jié)果 槲皮素在0.016 5～1.65 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），平均回收率為96.8%，RSD=2.02%；山柰素在0.014 6～1.46 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.999 5），平均回收率為97.3%，RSD=1.77%。結(jié)論 該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性較好，可用于山柰藥材中槲皮素和山柰素的含量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；山柰；槲皮素；山柰素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.020

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0077-03

Abstract： Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L.. Methods ODS2 C18 （5 μm， 4.6 mm×150 mm） was used as chromatographic column； methanol-0.4% phosphate （47：53） was the mobile phase； the flow rate was 1 mL/min； column temperature was 30 ℃； the detection wavelength was 367 nm； the injection volume was 10 μL. Results Quercetin showed good linear relationship in the range of 0.016 5–1.65 μg （r=0.999 7）. The average recovery rate was 96.8%， RSD=2.02%； kaempferol showed good linear relationship in the range of 0.014 6–1.46 μg （r=0.999 5）. The average recovery rate was 97.3%， RSD=1.77%. Conclusion The method is simple， accurate， and with good reproducibility， which can be used for content determination of quercetin and kaempferol in Kaempferia galanga L..

Key words： HPLC； Kaempferia galanga L.； quercetin； kaempferol

山柰為姜科植物山柰Kaempferia galanga L.的干燥根莖，主產(chǎn)于云南、廣東、廣西等地區(qū)，具有溫中散寒、行氣止痛等功效，臨床主要用于治療胸膈脹滿、脘腹冷痛、飲食不消、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等。近年來有關(guān)山柰的研究主要集中在山柰揮發(fā)油的提取、化學(xué)成分分析、生物活性等方面，而山柰中槲皮素、山柰素等黃酮類成分的報道較少[1-3]，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）對山柰藥材中的槲皮素、山柰素的含量進行測定，為控制藥材質(zhì)量、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等提供參考。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（包括CTO柱溫箱，SIL-10AF自動進樣器，LC-15C泵，SPD-15C紫外檢測器）。AUW-120D型分析天平（島津公司）、電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DFT-50手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

山柰素（中國食品藥品檢定研究院，批號110861- 201310）；槲皮素（中國食品藥品檢定所研究院，批號110754-201308）；甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20140318）；磷酸（南昌鑫光精細(xì)化工廠，分析純）；山柰藥材購自江西敦壽堂國藥有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)褚小蘭教授鑒定為姜科植物山柰Kaempferia galanga L.；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬ODS2 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸（47∶53）；流速：1 mL/min；檢測波長：367 nm；柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按山柰素峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2 混合對照品溶液的制備

取槲皮素、山柰素對照品適量，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0.165、0.146 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取山柰藥材適量，烘干、粉碎、過篩，取粉末（過65目）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密稱定，超聲提?。üβ?00 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再精密稱定，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液15 mL置于燒瓶中，加鹽酸溶液（15→37）5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，取出，置于冷水中迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[4]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取各對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定槲皮素和山柰素峰面積。以槲皮素、山柰素濃度對其峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：槲皮素Y=7E+0.6X-48 953，r=0.999 7；山柰素Y=7E+0.4X-49 731，r=0.999 5。結(jié)果表明，槲皮素在0.016 5～1.65 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，山柰素在0.014 6～1.46 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次進樣量10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定，計算峰面積，結(jié)果槲皮素峰面積RSD=1.89%，山柰素峰面積RSD=1.56%。表明精密度良好，符合含量測定的基本要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1”項下色譜條件測定，計算得槲皮素峰面積RSD=1.96%，山柰素峰面積RSD=2.14%，結(jié)果表明，山柰素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批山柰藥材粉末（過65目），按“2.3”項下方法平行制備6份樣品，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按2.1”項下色譜條件測定，計算得槲皮素峰面積RSD=1.48%，山柰素峰面積RSD=1.29%。結(jié)果表明，本方法測定山柰中山柰素的含量，重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批已知槲皮素及山柰素含量的山柰藥材粉末（過65目）6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別加入混合對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備溶液，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1、表2。

2.9 樣品含量測定

根據(jù)已建立的含量測定方法，取3批山柰藥材粉末（過65目），每批3份，稱取適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定其峰面積，分別代入線性回歸方程，計算山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量，結(jié)果3批樣品中槲皮素含量分別為0.082%、0.086%、0.079%，山柰素含量分別為0.066%、0.058%、0.063%，見表3。色譜圖見圖1。

3 討論

山柰除含有揮發(fā)油外，還有大量黃酮類化合物，如槲皮素、山柰素等，槲皮素具有清除氧自由基、抗過敏、抗菌、抗病毒、降血糖、防癌治癌等藥理活性，山柰素則具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)兗耙种艸IV蛋白酶活性等藥效?？梢姡借褪且环N極具發(fā)展?jié)摿Φ闹兴幉?，?010年版《中華人民共和國藥典》僅對山柰中揮發(fā)油的含量有規(guī)定，而未對槲皮素、山柰素等黃酮類成分含量進行規(guī)定，相關(guān)研究報道亦較少，故建立HPLC同時測定山柰藥材中槲皮素、山柰素等黃酮類含量的方法，對于藥材質(zhì)量控制、合理選用藥材等具有較大的借鑒意義[5-6]。

筆者考察了加熱回流提取法和超聲提取法的提取效果，結(jié)果顯示，2種方法所得提取物中槲皮素、山柰素含量未出現(xiàn)明顯的差異，但加熱回流法的出膏率較超聲提取法明顯增加，HPLC圖雜質(zhì)峰略有增加，影響槲皮素、山柰素的分離，故采用超聲提取法用于山柰中槲皮素、山柰素的提取。同時對提取時間進行了考察，分別比較了15、30、45、60 min的提取效果，結(jié)果顯示，槲皮素、山柰素在30 min內(nèi)基本提取完全，時間進一步延長，二者的含量未出現(xiàn)顯著提高，故含量測定時采用超聲提取30 min即可。

文獻報道，山柰藥材中槲皮素、山柰素等成分是以苷類的形式存在，提取物中僅含有少量的槲皮素、山柰素，不能較為客觀地反映其真實含量[7]，故測定山柰藥材中的槲皮素、山柰素時，需對提取物進行水解。筆者參考2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）紅花中山柰素含量測定的樣品處理方法，于提取物中加入適量稀鹽酸，水浴中加熱水解30 min即可[8-9]。試驗采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相，為了得到較好的分離效果，對流動相的比例進行了考察，結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇與0.4%磷酸溶液的比例為47∶53時，槲皮素、山柰素的出峰時間適中，分離度及峰形均比較好，可用于山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量測定。

結(jié)果表明，本研究所建立的方法具有專屬性強、回收率高、重復(fù)性好等特點，可快速、準(zhǔn)確地測定山柰藥材中槲皮素、山柰素的含量，對于評價藥材的質(zhì)量具有較大的參考價值。

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（收稿日期：2015-09-16）

（修回日期：2015-09-28；編輯：陳靜）