張靜，丁博，祁俊生，陳秀紅，周濃

1.重慶三峽學院環(huán)境與化學工程學院，重慶 404000；2.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 404000

三峽庫區(qū)栽培重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元含量測定

張靜1，丁博2，祁俊生1，陳秀紅1，周濃2

1.重慶三峽學院環(huán)境與化學工程學院，重慶 404000；2.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶 404000

目的建立高效液相色譜法測定重樓中薯蕷皂苷元含量，考察不同產(chǎn)地和不同品種重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元的含量。方法采用島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（92∶8）為流動相，流速1.0mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃。結果不同產(chǎn)地、不同品種的重樓屬藥材中均含有薯蕷皂苷元，渝北區(qū)的長藥隔重樓含量最高（6.813 7 mg/g），城口縣的狹葉重樓含量次之（5.758 4 mg/g），最低的為石柱縣的滇重樓（1.952 2 mg/g），表明不同栽培品種重樓藥材化學品質差異較大，可能與產(chǎn)地、品種及栽培技術等因素有關。結論非藥典品種長藥隔重樓、狹葉重樓含量超過中國藥典收載品種，具有較大的藥用價值。

重樓；薯蕷皂苷元；高效液相色譜法；質量評價

重樓主要活性成分為薯蕷皂苷和偏諾皂苷等類型，薯蕷皂苷通過水解可以得到薯蕷皂苷元［1-2］。薯蕷皂苷元是合成甾體激素類藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗炎、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性，為重樓藥材生物活性的物質基礎［3］。三峽地區(qū)為重樓屬藥用植物的地理分布中心之一，藥材品種較為豐富［4-5］，但存在種質來源復雜、分類不明等嚴重問題，導致其開發(fā)利用率較低。目前，已有對滇重樓［6］、七葉一枝花［7］、北重樓［8］等重樓藥材中薯蕷皂苷元含量測定的報道。本試驗采用高效液相色譜法（HPLC）測定重樓藥材中薯蕷皂苷元含量，并對比三峽庫區(qū)不同產(chǎn)地、不同品種重樓藥材質量，以期為三峽庫區(qū)重樓藥材資源的合理開發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司），RV 10 basic V型旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA集團），CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）。

重樓新鮮根莖采自重慶市開縣滿月鄉(xiāng)雙坪村1組等地，每份樣品均取10株成熟植株根莖以保證樣品代表性，并由中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定（見表 1）。薯蕷皂苷元對照品（批號 111539-200001，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用）。色譜純乙腈為德國默克公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

表1 重樓樣品來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（92∶8），流速為1.0mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL，采集時間10 min，理論板數(shù)以薯蕷皂苷元峰面積計不得低于4000。色譜圖見圖1。

圖1 重樓中薯蕷皂苷元HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

取薯蕷皂苷元對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.539 0 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

參照周氏等［6］方法略作修改。精密稱取本品粉末（過三號篩）約0.20g，置250mL具塞三角瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）2 h，棄石油醚，殘渣加入甲醇25mL，超聲提取（300 W，40 kHz）40 min，放冷，過濾，重復操作1次，合并濾液，減壓回收甲醇至干，加2 mol/L鹽酸10mL，置沸水浴中水解2.5 h，放冷，置分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）萃取3次，每次30mL，合并石油醚萃取液，水洗至中性，減壓回收石油醚至干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取對照品貯備溶液，采用逐級稀釋法分別制得薯蕷皂苷元的0.027 0、0.053 9、0.134 8、0.269 5、0.404 3、0.539 0 mg/mL對照品標準液。分別精密吸取對照品標準液20 μL，注入液相色譜儀，得進樣量（μg）與峰面積的線性方程。結果表明，薯蕷皂苷元在0.54～10.78 μg線性范圍內(nèi)其進樣量與峰面積具有良好的線性關系，回歸方程為Y=631 205X+52 970，r=0.999 8（n=6）。

2.5 精密度試驗

取同一供試品溶液（S3），按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣 6次，測得薯蕷皂苷元峰面積的 RSD= 0.35 %，表明儀器進樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（S3），室溫密閉放置，按“2.1”項下色譜條件在0～24 h每隔4 h測定1次，結果薯蕷皂苷元峰面積RSD=1.89%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取同一重樓樣品6份（S3），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果薯蕷皂苷元的平均含量為 2.539 5mg/g，RSD= 1.61%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知含量的重樓藥材粉末約0.10g（S3），共6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果表明，薯蕷皂苷元平均回收率為96.81%，RSD=1.48%，符合分析要求（見表2）。

表2 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品測定

分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，進樣前過0.22 μm微孔濾膜，進樣20 μL，進行HPLC分析，測定峰面積，以外標兩點法計算各重樓中薯蕷皂苷元的含量，結果見表3。

表3 不同產(chǎn)地不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量（mg/g，n=3）

3 討論

對不同流動相體系、檢測波長和供試品溶液的制備方法［6-8］進行了綜合考察，結果表明，以乙腈-水（92∶8）的流動相體系等度洗脫所得色譜峰分離效果最佳；檢測波長在203 nm處薯蕷皂苷元有最大吸收；甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min，超聲提取2次，酸水解、有機溶劑萃取即可將重樓中的薯蕷皂苷元基本提取完全。

本研究結果表明，三峽庫區(qū)不同產(chǎn)地的重樓藥材普遍含有薯蕷皂苷元，但同一品種的不同產(chǎn)地重樓藥材中薯蕷皂苷元含量存在較大差異，其中以重慶市城口縣與重慶市石柱縣產(chǎn)狹葉重樓中薯蕷皂苷元含量相差近2倍，重慶石柱縣與重慶市萬州區(qū)產(chǎn)滇重樓中薯蕷皂苷元含量也相差近2倍，但3個不同產(chǎn)地的七葉一枝花含量相差甚微，與付氏等［11］報道類似。造成三峽庫區(qū)不同產(chǎn)地重樓薯蕷皂苷元含量差異的原因，可能與栽培技術、產(chǎn)地環(huán)境等有關［9-11］，表明需加大對重樓的人工栽培技術和產(chǎn)地適宜性研究，以確保重樓藥材資源可持續(xù)利用和重樓醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

除2個中國藥典法定品種（七葉一枝花和滇重樓）外，筆者還采集到其他5個種/變種，試驗結果表明，重樓屬不同種植物的薯蕷皂苷元含量存在較大差異（1.952 2～6.813 7 mg/g），渝北區(qū)的長藥隔重樓含量最高，城口縣的狹葉重樓含量次之，最低的為石柱縣的滇重樓。不同品種間薯蕷皂苷元含量差異較大，非藥典品種能否代替重樓入藥有待進一步深入研究。

前期研究表明，重樓屬植物大部分品種均在入藥，且部分品種與中國藥典收載品種（滇重樓和七葉一枝花）具有一定的化學成分等同性［4，11-12］。本試驗結果進一步表明，不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量差別很大，而民間有代用的習慣，因此制定其含量標準是很有科學意義的。

致謝：中國科學院昆明植物研究所李恒研究員在植物標本鑒定中給予的幫助。

［1］ 黃賢校，高文遠，滿淑麗，等.重樓屬藥用植物皂苷類化學成分及其生源途徑的研究進展［J］.中草藥，2009，40（3）：483-489.

［2］ 吳珊，吳衛(wèi)，鄭有良.反相高效液相色譜法同時測定重樓藥材中 4種皂苷的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：1896-1897.

［3］ 盛芳園，何忠梅，陳凱，等.薯蕷皂苷元的提取分離、檢測方法及藥理作用研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（4）：914-917.

［4］ 劉正宇.重慶市三峽庫區(qū)藥用植物資源名錄［M］.重慶：重慶出版社，2007：585-587.

［5］ 張植瑋，劉正宇，陳玉菡，等.重慶三峽庫區(qū)重樓屬藥用植物資源調(diào)查［J］.資源開發(fā)與市場，2008，24（3）：254-256.

［6］ 周濃，郭吉芬，楊麗云，等.HPLC測定不同采收期滇重樓中薯蕷皂苷元的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（18）：54-56.

［7］ 李于善，周強，張玉針，等.三峽七葉一枝花薯蕷皂苷元的分離提取工藝研究［J］.化學世界，2009，50（2）：86-89.

［8］ 毛淑敏，劉娟.RP-HPLC法測定北重樓中薯蕷皂苷元的含量［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23（4）：65-66.

［9］ 楊斌，李紹平，嚴世武，等.滇重樓資源現(xiàn)狀及可持續(xù)利用研究［J］.中藥材，2012，35（10）：1698-1700.

［10］ 楊永紅，戴麗君，何昆鴻，等.土壤營養(yǎng)與人工栽培滇重樓品質相關性評價［J］.中藥材，2012，35（10）：1557-1561.

［11］ 付紹智，李楠，劉振，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地重樓屬植物中7種甾體皂苷成分［J］.中草藥，2012，43（12）：2435-2437.

［12］ 楊德全，楊勤，周濃.多基源重樓的質量等同性研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（3）：91-94.

Content Determ ination of Diosgenin in Paridis Rhizoma Medicinal Plants in Different Habitats of Three Gorges Reservoir

ZHANG Jing1， DING Bo2， QI Jun-sheng1， CHEN Xiu-hong1，ZHOU Nong2
（1. College of Environmental and Chemical Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000， China； 2. College of Life Science & Engineering， Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000， China）

ObjectiveTo establish an HPLC method to determine the content of diosgenin in Paridis Rhizoma； To examine contents of diosgenin in different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and from different habitats.MethodsShimadzu Inertsil ODS-C18guard column （150 mm×4.6 mm， 5μm） was used in HPLC system； elution conditions were the mobile phase using 92% acetonitrile and 8% water （isocraticelution） at a flow rate of 1.0mL/min with 203 nm detection wavelength. The temperature of the column oven was maintained at 30 ℃.ResultsDifferent varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and Paridis Rhizoma medicinal plants from different habitats contained diosgenin. TheParis polyphyllavar.pseudothibeticain Yubei district had the highest content （6.813 7 mg/g）；Paris polyphyllavar.stenophyllain Chengkou County had the middle content （5.758 4 mg/g）；Paris yunnanensisFranch in Shizhu county showed the lowest content （1.952 2 mg/g）. The results showed that the obvious difference of chem ical quality between various cultivated varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants， which might be related with origin，variety and the cultivation technology， and so on.ConclusionThe diosgenin contents ofParis polyphyllavar.pseudothibeticaandParis polyphyllavar.stenophyllawere higher than that of varieties recorded in Chinese Pharmacopeia.Paris polyphyllavar.pseudothibeticaandParis polyphyllavar.stenophyllahad important medical value.

Paridis Rhizoma； diosgenin； HPLC； quality evaluation

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.021

R284.1

A

1005-5304（2016）06-0080-04

2015-07-02）

（

2015-07-21；編輯：陳靜）

國家自然科學基金（81260622）；萬州區(qū)科委自然科學基金（201301024）；重慶市教委科學技術研究項目（KJ131109）

周濃，E-mail：erhaizn@126.com