王維娜 余琦

摘 要：目的 以野菊花的頭狀花序?yàn)樵?，建立有機(jī)溶劑-高速逆流色譜法（HSCCC）分離純化野菊花中蒙花苷和木犀草素的方法。方法 野菊花醇提物先經(jīng)過乙酸乙酯萃取初步分離，富集目標(biāo)化合物。然后，以乙酸乙酯-正丁醇-水（5∶1∶5）為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，流速5 mL/min，檢測波長340 nm，利用半制備型HSCCC分離純化蒙花苷和木犀草素。結(jié)果 經(jīng)過乙酸乙酯萃取富集-高速逆流色譜法分離后，一次性得到蒙花苷和木犀草素，經(jīng)HPLC檢測其純度分別為97.5%和98.4%。經(jīng)1H-NMR和13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu)為蒙花苷和木犀草素。結(jié)論 該研究為簡便，高效地制備野菊花中蒙花苷和木犀草素提供了參考。

關(guān)鍵詞：高速逆流色譜 野菊花 蒙花苷 木犀草素

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2016）01（a）-0159-02

野菊花（Chrysanthemi Indici Flos）系菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum L.）的干燥頭狀花序，味苦、辛，性涼，清熱解毒，疏風(fēng)平肝，用于疔瘡、癰腫、丹毒，風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、高血壓眩暈、頭痛等病癥，為臨床常用中藥。野菊花主要含黃酮類、萜類及揮發(fā)油類成分，其中蒙花苷和木犀草素是野菊花總黃酮中含量較高的代表性成分，同時(shí)，蒙花苷是我國2010和2015版藥典規(guī)定的野菊花藥材的質(zhì)控指標(biāo)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)蒙花苷和木犀草素具有抗缺氧、抗不良刺激、抗疲勞、雙向調(diào)節(jié)機(jī)體、抑制血糖升高和影響學(xué)習(xí)記憶等多種作用。由此可見，目標(biāo)成分的開發(fā)具有廣泛商業(yè)價(jià)值。

該實(shí)驗(yàn)購買市售野菊花藥材，經(jīng)乙酸乙酯萃取得到粗提取，以此粗提物經(jīng)HSCCC一步分離得到蒙花苷和木犀草素，純度均高于97.0%，為蒙花苷和木犀草素的開發(fā)制備提供了一種快速實(shí)用的新方法。目前，尚未見HSCCC分離制備野菊花中蒙花苷和木犀草素的相關(guān)報(bào)道。

1 儀器與材料

TBE-300C型高速逆流色譜儀、TBP-5002恒流泵和TBD-2000紫外檢測儀（上海同田生物技術(shù)股份有限公司）；DC-0506恒溫槽（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；HITACHI 高效液相色譜儀，色譜柱為Boston Crest C18柱；DPX-400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞典Bruker）；QP-5000質(zhì)譜（日本島津公司）。

野菊花粗提物的制備用工業(yè)酒精，HSCCC分離所用乙酸乙酯、正丁醇等溶劑均為分析純，HPLC所用乙腈為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；中藥材野菊花（批號20140902），購于亳州藥材市場，由上海中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)工程研究中心張繼全教授鑒定為野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序，并留樣保存。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Boston Crest C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相為乙腈：水（25：75）等度洗脫；檢測波長為334 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min。

2.2 樣品制備

稱取干燥的野菊花藥材粉末500 g，以70%乙醇為提取溶劑，料液比1∶8，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液并減壓濃縮干燥得到214 g浸膏。取浸膏30 g，用水混懸，依次用正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收萃取液，干燥得到3個(gè)組分。經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位富含蒙花苷和木犀草素，將其減壓干燥，得到4 g粗提物，用于HSCCC進(jìn)一步分離純化。

2.3 HSCCC分離制備

2.3.1 HSCCC溶劑體系的選擇

選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)是HSCCC成功分離的關(guān)鍵所在。該實(shí)驗(yàn)參考目標(biāo)物質(zhì)的極性大小，選擇合適的溶劑體系范圍，并通過具體測定K值來選擇最佳溶劑體系。將不同溶劑系統(tǒng)按不同比例配制，搖勻并靜置分層后，取適量粗提物用等體積的上下相充分混合溶解后，靜置分層。各取10μL上，下相進(jìn)行HPLC檢測，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，則K=A1/A2。

2.3.2 溶劑體系及樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制乙酸乙酯/正丁醇/水（5∶1∶5，v/v）兩相溶劑體系，充分振搖后室溫靜置分層，使用前將上下相分離，超聲脫氣20 min，待用。稱取500 mg乙酸乙酯萃取物，用溶劑體系的上下相各5 mL超聲溶解，備用。

2.3.3 目標(biāo)物質(zhì)分離制備

開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)定溫度為25 ℃，以30 mL/min的流速將上相（固定相）泵入主機(jī)管路，待液體流出時(shí)，改用5 mL/min的流速泵下相（流動相），同時(shí)以800 r/min的轉(zhuǎn)速啟動主機(jī)。觀察到流動相從管柱出口流出，且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液從進(jìn)樣口注入。紫外檢測器波長為340 nm，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖收集并減壓干燥目標(biāo)物質(zhì)。

2.4 目標(biāo)物質(zhì)的鑒定及純度檢測

采用1H-NMR和13C-NMR鑒定得到的目標(biāo)化合物1和2。經(jīng)HPLC檢測，以分析其純度。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取物的預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，野菊花醇提物直接進(jìn)樣HSCCC進(jìn)行分離，因組分過于復(fù)雜，固定相流失嚴(yán)重，進(jìn)樣量小，達(dá)不到理想的分離制備效果。通過不同極性有機(jī)溶劑的萃取進(jìn)行初步分離，尤其可以去掉大部分水溶性物質(zhì)，使目標(biāo)物質(zhì)得到較好的富集。

3.2 溶劑體系的選擇

高速逆流色譜中，溶劑體系的選擇至關(guān)重要，合適的溶劑體系是其分離的關(guān)鍵。通常篩選溶劑體系的方法有HPLC法，TLC法，UV法和分析型HSCCC的應(yīng)用。該研究采用HPLC測定樣品在上下相中的分配系數(shù)K值篩選合適的溶劑體系。

實(shí)驗(yàn)選取乙酸乙酯-甲醇-水（10∶1∶10；5∶1∶8），乙酸乙酯-正丁醇-水（5∶1∶5；5∶1∶8）體系作為分離的溶劑系統(tǒng)及不同配比，測定K值。當(dāng)乙酸乙酯-正丁醇-水為5∶1∶5時(shí)，K值分別是3.12和5.51，目標(biāo)化合物分離度較好，且可以和前后雜質(zhì)分開；固定相保留率為66.7%，分離時(shí)間適中，HSCCC分離色譜圖見圖1。

3.3 HSCCC分離參數(shù)的確定

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的溫度，主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速。結(jié)果表明，在20 ℃～30 ℃范圍內(nèi)均獲得較理想的效果，故溫度定為25 ℃。分離度一般隨著轉(zhuǎn)速的增加而增大，但轉(zhuǎn)速增加會引發(fā)乳化現(xiàn)象，900 r/min時(shí)固定相可見明顯流失，因此800 r/min是比較適宜的工作轉(zhuǎn)速。流速越大，固定相保留率越低，分離時(shí)間越短，分離度越低，因此，需要在保證分離度的前提下盡可能縮短分離時(shí)間，最終采用5 mL/min的流速。綜上所述，選定的HSCCC分離條件為：25 ℃，800 r/min，5 mL/min。HSCCC分離圖譜見圖1。

3.4 產(chǎn)物純度分析及結(jié)構(gòu)鑒定

按“2.1”節(jié)條件對HSCCC所得化合物1和2進(jìn)行HPLC分析，經(jīng)面積歸一化法計(jì)算可知目標(biāo)物質(zhì)純度分別為97.5%和98.4%，如圖2所示。

采用1H-NMR和13C-NMR鑒定，經(jīng)光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照，鑒定化合物1為蒙花苷，化合物2為木樨草素。

4 結(jié)語

該實(shí)驗(yàn)通過有機(jī)溶劑萃取富集和高速逆流色譜分離純化，從野菊花粗提物中一步分離制備了蒙花苷和木樨草素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HSCCC可以分離制備得到高純度的蒙花苷和木樨草素，分離周期短，操作快捷簡便，為從野菊花中分離純化蒙花苷和木樨草素提供了很好的技術(shù)方案。

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