周世豪　李磊　符悅冠

摘 要 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，測(cè)定瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個(gè)備選內(nèi)參基因分別在25（CK）、37、45 ℃下處理1 h的mRNA水平表達(dá)情況，并借助Bestkeeper、Normfinder和GeNorm程序分析5個(gè)備選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性。篩選得出BestKeeper：SD值排序?yàn)镾D（0.06）=GAPDH（0.06）關(guān)鍵詞 高溫脅迫；瓜實(shí)蠅；內(nèi)參基因

中圖分類(lèi)號(hào) Q963 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To select suitable reference genes in the adult female Bactrocera cucurbitae after the treatment of different high temperature stress， We determined the female adult of B. cucurbitae the mRNA expression stability of five candidate reference genes（GAPDH， SD， β-TUB， ACT and RPL13）after the treatment of temperature stress（1 h）at 25 ℃（CK）， 37 ℃ and 45 ℃ by RT-qPCR method. Then three software-based approaches（Bestkeeper， Normfinder and GeNorm）were used to evaluate the expression stability of the five candidate reference genes. The SD values of the five reference genes stability by BestKeeper method in the ascending order were SD（0.06）=GAPDH（0.06）

BestKeeper程序通過(guò)取候選內(nèi)參基因Ct值的幾何平均數(shù)，依據(jù)其大小，對(duì)候選基因配對(duì)差異分析后進(jìn)行排序[12]。NormFinder和GeNorm將各候選基因的Ct值采取線性方程進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使其最高相對(duì)表達(dá)量賦予數(shù)值1，NormFinder是直接計(jì)算算出各候選基因的表達(dá)穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小對(duì)應(yīng)基因越穩(wěn)定[13]。GeNorm則是先計(jì)算各候選內(nèi)參基因的整體情況，而不是對(duì)單一內(nèi)參基因進(jìn)行評(píng)價(jià)，這樣更有利于減小誤差，最終給出一個(gè)穩(wěn)定值，該值越小越穩(wěn)定[13]。Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種程序各有利弊，應(yīng)結(jié)合一起對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

本文基于前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用RT-qPCR以及Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種程序分析GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個(gè)備選內(nèi)參基因分別在25、37、45 ℃下處理1 h的mRNA水平表達(dá)穩(wěn)定性，以便篩選出瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)在高溫脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的合適內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲(chóng)和養(yǎng)蟲(chóng)管理 實(shí)驗(yàn)所用蟲(chóng)源采自海南省澄邁縣苦瓜地，繼而在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用人工飼料進(jìn)行擴(kuò)繁，幼蟲(chóng)飼料配方為：酵母粉100 g；玉米粉500 g；苯甲酸鈉2 g；蔗糖100 g；南瓜500 g；濃鹽酸4 mL；水500 mL。成蟲(chóng)飼料為：酵母粉：蔗糖（w ∶ w）=1 ∶ 1。建立穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)室種群。室內(nèi)平均溫度（25±1）℃，RH為（70±5）%，14L ∶ 10D。本研究中所用的實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)均為初羽化的瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)。將所有供試蟲(chóng)分別放入已設(shè)置好溫度的不同光照培養(yǎng)箱中，于25（CK，最適溫度）、37、45 ℃下處理1 h，處理完后迅速放入液氮中速凍，置于-80 ℃下備用，各個(gè)溫度處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.1.2 主要試劑和儀器 Allprep組織/細(xì)胞RNA/DNA分提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，RN29）；第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司，B532445-0020）；Marker（上海生工生物工程有限公司，B300721-0125）；TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金生物科技有限公司，AQ101-02）；全自動(dòng)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司，7500）；普通PCR儀（Bio-Rad T100）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA合成 按照Allprep試劑盒操作說(shuō)明提取各溫度條件下瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)總RNA，繼而用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。按照第一鏈cDNA合成試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個(gè)備選內(nèi)參基因相關(guān)序列，使用在線引物設(shè)計(jì)軟件NCBI Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)引物。各引物序列見(jiàn)表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR分析 根據(jù)表1中各引物分別對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR分析，以驗(yàn)證所設(shè)引物的可行性。PCR反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA，10 μL 2×power Taq Master Mix，正、反向引物各0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.4 RT-qPCR分析 RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL TransStart Green qPCR SuperMix，2 μL cDNA，正、反向引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，75 ℃ 15 s， 40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增程序結(jié)束后，進(jìn)行融解曲線分析，從72 ℃到95 ℃ 15 s，之后降至60 ℃ 1 min，然后溫度逐漸上升至95 ℃，期間升溫速度5 ℃/s，最后95 ℃再持續(xù)10 s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將RT-qPCR分析所得到的不同溫度處理下每個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct值，按照要求輸入至Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種分析程序中。Bestkeeper分析程序，通過(guò)對(duì)輸入不同候選內(nèi)參基因的Ct值，對(duì)樣品進(jìn)行相關(guān)性配對(duì)分析，并算出標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。以SD<1作為評(píng)判候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性界限，SD 值越小，其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因越穩(wěn)定。Normfinder分析程序，采用同處理組內(nèi)方差與不同處理間方差相結(jié)合方法，計(jì)算出穩(wěn)定值，該值越小，其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因越穩(wěn)定。GeNorm分析程序，通過(guò)逐步刪掉最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，每步均計(jì)算每個(gè)基因的M值，M值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定，直至保留最佳內(nèi)參基因?yàn)橹埂?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 提取總RNA質(zhì)量檢測(cè)

按照Allprep試劑盒操作說(shuō)明，提取25、37和45 ℃下處理1 h后瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)總RNA，繼而用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1顯示，3種不同溫度處理提取總RNA 都含有明顯的28S、18S和5S三條帶，18S條帶最明顯，點(diǎn)樣孔和泳道無(wú)明顯雜質(zhì)殘留，說(shuō)明提取總RNA完整性較好，無(wú)蛋白和DNA污染，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR分析結(jié)果

各候選內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，各候選內(nèi)參基因均檢測(cè)到預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，各條帶單一清晰，無(wú)其它非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明各候選內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)合理，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 RT-qPCR分析結(jié)果

對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)處理熔解曲線均只產(chǎn)生單一的熔解峰，不存在引物二聚體等非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。不同溫度處理下各候選內(nèi)參基因的Ct值在16～26之間（表2），其中β-TUB表達(dá)量最高，其Ct值在25.2～25.9之間，GAPDH表達(dá)量最低，其Ct值在16.7～16.9之間。

將上述所得各候選內(nèi)參基因Ct值，按照要求代入BestKeeper、Normfinder和GeNorm內(nèi)參基因分析程序，結(jié)果見(jiàn)表3。

BestKeeper分析程序顯示，各候選內(nèi)參基因SD值均小于1，均在穩(wěn)定界限內(nèi)，SD值排序?yàn)椋篠D（0.06）=GAPDH（0.06）3 討論與結(jié)論

本文選定的5個(gè)瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)候選內(nèi)參基因GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13，經(jīng)RT- qPCR方法分析后表明，在不同溫度條件下各個(gè)基因的Ct值并不相同，對(duì)在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性篩選極其重要。采用BestKeeper、Normfinder和GeNorm 3種不同分析程序?qū)?個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以看出，不同的分析程序?qū)?nèi)參基因的穩(wěn)定性排序也有差異，這是因?yàn)椴煌姆治龀绦蛩惴ú煌瑢?dǎo)致[14]，因此，應(yīng)結(jié)合不同的分析程序，對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，基因的表達(dá)存在差異，從而導(dǎo)致蛋白層面的差異，因此，在不同實(shí)驗(yàn)條件下，選擇合適的內(nèi)參基因，mRNA水平上的定量分析對(duì)了解目標(biāo)基因功能，解釋相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象極其重要[15]。申建梅等[16]在23～26 ℃的條件下，以ACT為內(nèi)參基因，對(duì)瓜實(shí)蠅嗅覺(jué)受體基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平不同進(jìn)行了研究，而在本文高溫的條件中，ACT基因的表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估并不是最佳。在與瓜實(shí)蠅同為雙翅目的近緣種桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）內(nèi)參基因的篩選中，對(duì)高效氯氰菊酯對(duì)桔小實(shí)蠅看家基因穩(wěn)定性的影響研究[17]，篩選出RPL13比SD的表達(dá)穩(wěn)定性高，而本文結(jié)果與之相反，這些研究結(jié)果與本文結(jié)果異同是因?yàn)檠芯糠N類(lèi)和不同的實(shí)驗(yàn)條件所致。

瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)是多寄主、耐熱型害蟲(chóng)，高溫對(duì)其生命活動(dòng)有極其重要的影響[18]。在高溫脅迫下，昆蟲(chóng)表現(xiàn)出相應(yīng)的生態(tài)、行為、生理生化等變化，如存活率下降，羽化率降低，發(fā)育歷期延長(zhǎng)、酶活性不同、DNA和蛋白質(zhì)差異表達(dá)等[19]。本文在前期對(duì)瓜實(shí)蠅雌成蟲(chóng)在25（CK）、37和45 ℃條件下處理1 h進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，了解相關(guān)的候選內(nèi)參基因序列的基礎(chǔ)上，采用RT-qPCR方法對(duì)5個(gè)備選內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證及評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出目的基因，了解目的基因在蟲(chóng)體高溫條件下的表達(dá)狀況，進(jìn)而利用RNA干擾技術(shù)在特定時(shí)間對(duì)目的基因進(jìn)行沉默表達(dá)，達(dá)到高溫條件下防治瓜實(shí)蠅的目的，與傳統(tǒng)單從基因的角度分析相比[16]，增加針對(duì)性和目的性。本文結(jié)果還可為結(jié)合瓜實(shí)蠅在高溫條件下其它方面的生命活動(dòng)現(xiàn)象，共同闡明瓜實(shí)蠅在高溫條件下的響應(yīng)機(jī)制，有助于提高瓜實(shí)蠅種群高溫條件下預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，為瓜實(shí)蠅的高溫防治效果奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：趙軍明