周世豪　李磊　符悅冠

摘 要 基于實時熒光定量PCR技術，測定瓜實蠅雌成蟲GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個備選內參基因分別在25（CK）、37、45 ℃下處理1 h的mRNA水平表達情況，并借助Bestkeeper、Normfinder和GeNorm程序分析5個備選內參基因表達的穩(wěn)定性。篩選得出BestKeeper：SD值排序為SD（0.06）=GAPDH（0.06）關鍵詞 高溫脅迫；瓜實蠅；內參基因

中圖分類號 Q963 文獻標識碼 A

Abstract To select suitable reference genes in the adult female Bactrocera cucurbitae after the treatment of different high temperature stress， We determined the female adult of B. cucurbitae the mRNA expression stability of five candidate reference genes（GAPDH， SD， β-TUB， ACT and RPL13）after the treatment of temperature stress（1 h）at 25 ℃（CK）， 37 ℃ and 45 ℃ by RT-qPCR method. Then three software-based approaches（Bestkeeper， Normfinder and GeNorm）were used to evaluate the expression stability of the five candidate reference genes. The SD values of the five reference genes stability by BestKeeper method in the ascending order were SD（0.06）=GAPDH（0.06）

BestKeeper程序通過取候選內參基因Ct值的幾何平均數，依據其大小，對候選基因配對差異分析后進行排序[12]。NormFinder和GeNorm將各候選基因的Ct值采取線性方程進行轉化，使其最高相對表達量賦予數值1，NormFinder是直接計算算出各候選基因的表達穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小對應基因越穩(wěn)定[13]。GeNorm則是先計算各候選內參基因的整體情況，而不是對單一內參基因進行評價，這樣更有利于減小誤差，最終給出一個穩(wěn)定值，該值越小越穩(wěn)定[13]。Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種程序各有利弊，應結合一起對內參基因進行綜合評價。

本文基于前期轉錄組測序的基礎上，利用RT-qPCR以及Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種程序分析GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個備選內參基因分別在25、37、45 ℃下處理1 h的mRNA水平表達穩(wěn)定性，以便篩選出瓜實蠅雌成蟲在高溫脅迫下表達穩(wěn)定的合適內參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲和養(yǎng)蟲管理 實驗所用蟲源采自海南省澄邁縣苦瓜地，繼而在本實驗室內采用人工飼料進行擴繁，幼蟲飼料配方為：酵母粉100 g；玉米粉500 g；苯甲酸鈉2 g；蔗糖100 g；南瓜500 g；濃鹽酸4 mL；水500 mL。成蟲飼料為：酵母粉：蔗糖（w ∶ w）=1 ∶ 1。建立穩(wěn)定實驗室種群。室內平均溫度（25±1）℃，RH為（70±5）%，14L ∶ 10D。本研究中所用的實驗昆蟲均為初羽化的瓜實蠅雌成蟲。將所有供試蟲分別放入已設置好溫度的不同光照培養(yǎng)箱中，于25（CK，最適溫度）、37、45 ℃下處理1 h，處理完后迅速放入液氮中速凍，置于-80 ℃下備用，各個溫度處理均設3個重復。

1.1.2 主要試劑和儀器 Allprep組織/細胞RNA/DNA分提試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，RN29）；第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司，B532445-0020）；Marker（上海生工生物工程有限公司，B300721-0125）；TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金生物科技有限公司，AQ101-02）；全自動熒光定量PCR反應擴增儀（美國ABI公司，7500）；普通PCR儀（Bio-Rad T100）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和第一鏈cDNA合成 按照Allprep試劑盒操作說明提取各溫度條件下瓜實蠅雌成蟲總RNA，繼而用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。按照第一鏈cDNA合成試劑盒操作說明反轉錄合成第一鏈cDNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 根據前期轉錄組測序結果，篩選出GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13共5個備選內參基因相關序列，使用在線引物設計軟件NCBI Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計引物。各引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR分析 根據表1中各引物分別對5個候選內參基因進行PCR分析，以驗證所設引物的可行性。PCR反應體系為20 μL：1 μL cDNA，10 μL 2×power Taq Master Mix，正、反向引物各0.4 μL，ddH2O補足體積至20 μL。擴增程序：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測各個反應產物。

1.2.4 RT-qPCR分析 RT-qPCR反應體系為20 μL：10 μL TransStart Green qPCR SuperMix，2 μL cDNA，正、反向引物各1 μL，ddH2O補足體積至20 μL。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，75 ℃ 15 s， 40個循環(huán)。擴增程序結束后，進行融解曲線分析，從72 ℃到95 ℃ 15 s，之后降至60 ℃ 1 min，然后溫度逐漸上升至95 ℃，期間升溫速度5 ℃/s，最后95 ℃再持續(xù)10 s。

1.3 數據分析

將RT-qPCR分析所得到的不同溫度處理下每個候選內參基因的Ct值，按照要求輸入至Bestkeeper、Normfinder和GeNorm 3種分析程序中。Bestkeeper分析程序，通過對輸入不同候選內參基因的Ct值，對樣品進行相關性配對分析，并算出標準差（SD）。以SD<1作為評判候選內參基因穩(wěn)定性界限，SD 值越小，其對應的內參基因越穩(wěn)定。Normfinder分析程序，采用同處理組內方差與不同處理間方差相結合方法，計算出穩(wěn)定值，該值越小，其對應的內參基因越穩(wěn)定。GeNorm分析程序，通過逐步刪掉最不穩(wěn)定的候選內參基因，每步均計算每個基因的M值，M值越小，內參基因越穩(wěn)定，直至保留最佳內參基因為止。

2 結果與分析

2.1 提取總RNA質量檢測

按照Allprep試劑盒操作說明，提取25、37和45 ℃下處理1 h后瓜實蠅雌成蟲總RNA，繼而用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，結果見圖1。由圖1顯示，3種不同溫度處理提取總RNA 都含有明顯的28S、18S和5S三條帶，18S條帶最明顯，點樣孔和泳道無明顯雜質殘留，說明提取總RNA完整性較好，無蛋白和DNA污染，可用于后續(xù)實驗。

2.2 PCR分析結果

各候選內參基因PCR產物電泳檢測結果見圖2。從圖2可見，各候選內參基因均檢測到預期大小的PCR產物，各條帶單一清晰，無其它非特異性擴增產物，說明各候選內參基因引物設計合理，可以進行后續(xù)實驗。

2.3 RT-qPCR分析結果

對5個候選內參基因進行RT-qPCR分析，結果表明，各實驗處理熔解曲線均只產生單一的熔解峰，不存在引物二聚體等非特異擴增產物。不同溫度處理下各候選內參基因的Ct值在16～26之間（表2），其中β-TUB表達量最高，其Ct值在25.2～25.9之間，GAPDH表達量最低，其Ct值在16.7～16.9之間。

將上述所得各候選內參基因Ct值，按照要求代入BestKeeper、Normfinder和GeNorm內參基因分析程序，結果見表3。

BestKeeper分析程序顯示，各候選內參基因SD值均小于1，均在穩(wěn)定界限內，SD值排序為：SD（0.06）=GAPDH（0.06）3 討論與結論

本文選定的5個瓜實蠅雌成蟲候選內參基因GAPDH、SD、β-TUB、ACT和RPL13，經RT- qPCR方法分析后表明，在不同溫度條件下各個基因的Ct值并不相同，對在不同的實驗條件下，內參基因表達穩(wěn)定性篩選極其重要。采用BestKeeper、Normfinder和GeNorm 3種不同分析程序對5個候選內參基因的穩(wěn)定性進行評價，可以看出，不同的分析程序對內參基因的穩(wěn)定性排序也有差異，這是因為不同的分析程序算法不同導致[14]，因此，應結合不同的分析程序，對內參基因表達穩(wěn)定性進行評價。

在不同的實驗條件下，基因的表達存在差異，從而導致蛋白層面的差異，因此，在不同實驗條件下，選擇合適的內參基因，mRNA水平上的定量分析對了解目標基因功能，解釋相關生物學現象極其重要[15]。申建梅等[16]在23～26 ℃的條件下，以ACT為內參基因，對瓜實蠅嗅覺受體基因在各個發(fā)育時期的表達水平不同進行了研究，而在本文高溫的條件中，ACT基因的表達穩(wěn)定性評估并不是最佳。在與瓜實蠅同為雙翅目的近緣種桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）內參基因的篩選中，對高效氯氰菊酯對桔小實蠅看家基因穩(wěn)定性的影響研究[17]，篩選出RPL13比SD的表達穩(wěn)定性高，而本文結果與之相反，這些研究結果與本文結果異同是因為研究種類和不同的實驗條件所致。

瓜實蠅雌成蟲是多寄主、耐熱型害蟲，高溫對其生命活動有極其重要的影響[18]。在高溫脅迫下，昆蟲表現出相應的生態(tài)、行為、生理生化等變化，如存活率下降，羽化率降低，發(fā)育歷期延長、酶活性不同、DNA和蛋白質差異表達等[19]。本文在前期對瓜實蠅雌成蟲在25（CK）、37和45 ℃條件下處理1 h進行轉錄組測序，了解相關的候選內參基因序列的基礎上，采用RT-qPCR方法對5個備選內參基因進行驗證及評價其穩(wěn)定性，為進一步利用轉錄組測序結果，篩選出目的基因，了解目的基因在蟲體高溫條件下的表達狀況，進而利用RNA干擾技術在特定時間對目的基因進行沉默表達，達到高溫條件下防治瓜實蠅的目的，與傳統單從基因的角度分析相比[16]，增加針對性和目的性。本文結果還可為結合瓜實蠅在高溫條件下其它方面的生命活動現象，共同闡明瓜實蠅在高溫條件下的響應機制，有助于提高瓜實蠅種群高溫條件下預測的準確性，為瓜實蠅的高溫防治效果奠定基礎。

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責任編輯：趙軍明