胡春吉 鄒良平 彭明
摘 要 木薯具有產(chǎn)量高、抗貧瘠等特點,為了了解其耐貧瘠的作用機理,提高木薯在貧瘠土壤中對氮素的利用率,以培養(yǎng)20 d的“華南5號”木薯組培苗為實驗材料,采用同源克隆和RT-PCR技術(shù),獲得一個高親和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白(NRT2)基因,命名為MeNRT2.1,該基因含有1 593 bp的開放閱讀框架,編碼530個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,木薯MeNRT2.1與苜蓿、擬南芥、可可、楊樹等物種的NRT2.1同源性高,其中與可可樹TcNRT2.1的親緣關(guān)系最近,氨基酸相似性達(dá)到90%。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,MeNRT2.1在木薯組培苗的根中表達(dá),并且在NO3-濃度為0.2 mmol/L時,其相對表達(dá)量較高,NO3-濃度為10 mmol/L時其相對表達(dá)量較低,NO3-濃度為0時幾乎不表達(dá);MeNRT2.1在莖、葉中也幾乎不表達(dá),即該基因具有誘導(dǎo)型組織特異性表達(dá)模式。原生質(zhì)體瞬時表達(dá)發(fā)現(xiàn)MeNRT2.1定位在細(xì)胞膜上。此研究為進(jìn)一步通過NRT2基因提高木薯的抗逆性奠定了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞 木薯;硝態(tài)氮;NRT2;實時熒光定量PCR;亞細(xì)胞定位
中圖分類號 S533 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A
Abstract Cassava(Manihot esculenta Crantz)has several agronomic traits like a high yield combined with low-nutrient soils tolerance. To insight into the molecular basis for tolerance of poor soils and improve the utilization rate of nitrate in cassava,the“Huanan 5”cassava cultivar grown for 20 days in a medium containing different nitrate concentrations was used as the experimental material in this study. The full-length cDNA encoding a high-affinity nitrate transporter gene, designated MeNRT2.1,was isolated from cassava by using homologous cloning and RT-PCR techniques,MeNRT2.1 was 1 899 bp in length and contained an open reading frame of 1 593 bp. Sequence analysis revealed that the ORF of MeNRT2.1 encoded 530 amino acid residues. Phylogeneticanalyses showed that MeNRT2.1 was highly homologous to MtNRT2,AtNRT2,TcNRT2 and PtNRT2. The closest homolog of MeNRT2.1 is Theobroma cacao NRT2.1,with 90% amino acid identity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the MeNRT2.1 transcript of root under 0.2 mmol/L NO3-1 treatment was the highest among the three nitrate concentrations,and had a low level on 10 mmol/L in root. However,there was almost no level without nitrate in root. Little MeNRT2.1 mRNA was found in other examinated tissues. Therefore,the expression of MeNRT2.1 is induced and specific pattern. Subcellular localization of the fusion protein of MeNRT2.1 with GFP only appeared in the cytomembrane. It provides an important foundation for future studies of regulation under the condition of poor stress about this gene.
Key words Cassava;Nitrate nitrogen;NRT2;Quantitative real-time PCR;Subcellular localization
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.01.020
木薯(Manihot esculenta Crantz)屬于大戟科木薯屬植物,起源于熱帶美洲,既是世界三大薯之一[1],也是全球六大糧食作物之一。木薯具有高光效、高淀粉產(chǎn)量、抗旱、耐貧瘠等特點,即使在非常貧瘠的土地上也能獲得一定的產(chǎn)量[2]。而氮素是植物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一,同時也是組成植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、酶類和維生素、生物堿、葉綠素以及其他數(shù)千種物質(zhì)的重要成分之一[3]。植物體內(nèi)的氮素水平直接或間接影響植物的生理生化過程及生長發(fā)育[4],而氮素對木薯產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率可達(dá)50%以上[5]。
NO3-和NH4+是植物根系從土壤中獲得氮素的最主要的2種形式。根系中NO3-的吸收與轉(zhuǎn)運是由硝酸鹽轉(zhuǎn)運體(Nitrate transporters, NRTs)實現(xiàn)的[6],當(dāng)外界可利用的NO3-濃度低時(<1 mmol/L),其吸收主要依靠高親和轉(zhuǎn)運體系(the high-affinity transport system HATS)完成;當(dāng)外界可利用NO3-濃度高時(>1 mmol/L),其吸收主要依靠低親和轉(zhuǎn)運體系(the low-affinity transport system LATS)完成[7-8]。
到目前為止,前人已經(jīng)從擬南芥中鑒定出53個低親和(NRT1)與7個高親和(NRT2)NO3-轉(zhuǎn)運蛋白基因[9]。NO3-在100~50 mmol/L時,基因表達(dá)量與NO3-吸收量的相關(guān)系數(shù)說明高親和與低親和的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中主要是AtNRT2.1和AtNRT1.1在起作用[10]。AtNRT2.1在根中強烈表達(dá),Wirth等[11]通過綠色熒光蛋白融合和免疫學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn),AtNRT2.1主要定位于擬南芥根皮層和表皮的質(zhì)膜上。Hu等[12]研究表明水稻Nrt1.1B定位于細(xì)胞膜,對NO3-從根到葉的運輸有重要作用,提高了粳稻對硝酸鹽的利用率。徐海榮等[13]發(fā)現(xiàn)在不同氮源及不同氮濃度條件下,OsNrt2.1在水稻根中的表達(dá)均高于葉,表明OsTNrt2.1對根系吸收NO3-可能具有重要作用。Quesada等[14]通過Northern雜交發(fā)現(xiàn),NpNRT2.1在煙草根中強烈表達(dá)。Amarasinghe等[15]發(fā)現(xiàn),通過低濃度硝酸鹽誘導(dǎo),GmNRT2基因在大豆根中表達(dá)強烈,屬于HATS??酌舻萚16]研究表明,白菜BcNRT2在白菜根部的表達(dá)量最高,而且在高低2種濃度的NO3-處理下均具有較高水平的表達(dá)量。同樣,在大麥[17]、玉米[18]等植物中也克隆鑒定出了NRT2基因。而關(guān)于木薯中硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因家族的報道卻很少。
本研究成功克隆出了木薯MeNRT2.1基因的編碼序列,并對其序列特征及時空表達(dá)情況進(jìn)行了研究分析,為該基因的進(jìn)一步應(yīng)用以及木薯NO3-吸收轉(zhuǎn)運積累機制的深入研究提供了理論參考。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供試材料“華南五號”木薯(Manihot esculenta Crantz)由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。
1.1.2 菌種、質(zhì)粒和試劑 大腸桿菌(E. coli) DH5α、pCAMBIA1302植物表達(dá)載體由本實驗室保存。PMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、實時熒光定量PCR試劑SYBRR Premix Ex TaqTMⅡ等均購自TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自中科瑞泰公司。反轉(zhuǎn)錄試劑FastQuant RT Kit購自天根生化科技有限公司。其它生化試劑和常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。
1.2 方法
1.2.1 木薯組培苗硝態(tài)氮誘導(dǎo)處理 將發(fā)育狀態(tài)基本一致的木薯組培苗在KNO3梯度培養(yǎng)基中進(jìn)行處理,培養(yǎng)基KNO3濃度依次為0、0.2、10 mmol/L。植株幼苗生長條件為光周期12 h/12 h,溫度25 ℃,相對濕度50%。幼苗培養(yǎng)20 d后,采集各處理根、莖、葉作為試驗材料,用液氮速凍后將其儲存于-80 ℃冰箱內(nèi),備用。
1.2.2 RNA的提取純化及cDNA的合成 參照阮孟斌等[19]提取總RNA的方法提取“華南5號”木薯組培苗樣品根、莖、葉的總RNA,并使用1.0%瓊脂糖凝膠對RNA質(zhì)量進(jìn)行電泳檢測。使用FastQuant RT Kit對RNA進(jìn)行純化,并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
1.2.3 木薯MeNRT2.1基因編碼序列的克隆 根據(jù)已報道的擬南芥AtNRT2.1基因,利用BioEdit與木薯全基因組進(jìn)行BLAST檢索,初步獲得木薯NRT2基因,根據(jù)JGI(http://www.phytozome.net/search.php)中收錄的MeNRT2.1(cassava4.1_031095m)
DNA序列為參考,采用Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計MeNRT2.1基因的上下游引物,在上游引物5′端引入保護(hù)堿基、BglⅡ酶切位點和補充堿基G,在下游引物5′端引入保護(hù)堿基和SpeⅠ酶切位點。引物序列如下:
P1 5′-GGAAGATCTGATGGCTGATATTGAGG
GTTCTC-3'(Bgl Ⅱ)
P2 5′-GGACTAGTGACATGGACTGGTGTAGTG
TTCG-3′(SpeⅠ)
以低濃度KNO3誘導(dǎo)的木薯組培苗根部cDNA 第一鏈為模板進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 110 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物移至1%的瓊脂糖凝膠中,電泳檢測是否有特異條帶出現(xiàn),對特異條帶進(jìn)行回收。依照PMD18-T Vector Cloning Kit,將PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接,采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落搖菌,進(jìn)行菌液PCR檢測,將獲得的PCR陽性克隆命名為pMD18T-MeNRT2.1,送往上海生工生物工程有限公司測序。
1.2.4 木薯MeNRT2.1基因序列特點及其氨基酸序列進(jìn)化分析 根據(jù)JGI公布的MeNRT2.1基因DNA序列及cDNA序列,利用NCBI Spidey (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)分析基因結(jié)構(gòu)。利用DNAMAN繪制基因結(jié)構(gòu)圖,推導(dǎo)出氨基酸序列?;蚓幋a蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protpar-
am(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)。采用在線工具(http://www.predictprotein.org/)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。利用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。利用MEGA 5.1軟件,以鄰位相近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹。
1.2.5 綠色熒光蛋白(GFP)融合載體的構(gòu)建及鑒定 將序列正確的含有pMD18T-MeNRT2.1的大腸桿菌抽取質(zhì)粒,用BglⅡ/SpeⅠ雙酶切對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定;將MeNRT2.1基因的全長CDS連接到含有GFP的植物表達(dá)載體pC1302,把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)Kan抗性篩選,挑取單克隆,再次用基因特異引物進(jìn)行菌落PCR鑒定[20],抽取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定,構(gòu)建出正確的GFP融合載體pC1302- MeNRT2.1(圖1)。以pC1302空載體作為對照。
1.2.6 煙草原生質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化 取健康煙草葉片用無菌水洗凈,使用刀片將葉片切成1 mm左右的細(xì)條,將其置于酶解液中,抽真空10 min,于23 ℃ 暗培養(yǎng)6 h。煙草葉肉原生質(zhì)體的分離、酶解液及W5反應(yīng)液的配制參照Sheen[21]的方法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考Yoo等[22]的PEG轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體的方法。待轉(zhuǎn)化細(xì)胞暗培養(yǎng)24 h左右,用OLYMPU激光共聚焦顯微鏡(FV1000)觀察原生質(zhì)體中的熒光分布。
1.2.7 木薯MeNRT2.1基因?qū)崟r定量PCR分析
利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的方法檢測木薯MeNRT2.1基因在不同濃度KNO3中根部的表達(dá)情況。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計規(guī)則,在此基因非保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計MeNRT2.1的定量引物,以木薯MeACT基因作為目標(biāo)基因定量表達(dá)的內(nèi)參基因,引物序列見表1,以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR,樣本和內(nèi)參分別設(shè)置3個重復(fù)。依據(jù)TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)說明書進(jìn)行,擴增程序為:第一步預(yù)變性,95 ℃ 30 s;第二步,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)45次。
1.3 數(shù)據(jù)分析
試驗數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行分析,獲得MeNRT2.1的相對表達(dá)量。RNA-seq高通量測序由北京諾和致源生物信息科技有限公司完成。
2 結(jié)果與分析
2.1 MeNRT2.1基因cDNA的克隆
以JGI(http://www.phytozome.net/search.php)中收錄的MeNRT2.1(cassava4.1_031095m)DNA序列為參考設(shè)計引物,以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增,結(jié)果見圖2,經(jīng)測序可知獲得1 593 bp含有完整編碼序列的cDNA序列,命名為MeNRT2.1。
2.2 MeNRT2.1編碼蛋白特性分析
MeNRT2.1基因全長1 899 bp,含有2個外顯子,1個內(nèi)含子(圖3),含有1 593 bp的開放式閱讀框架(Open reading frame,ORF),編碼530個氨基酸(圖4)?;蚓幋a蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam,推測其蛋白相對分子質(zhì)量為57.26 ku,等電點為9.28。在組成 NRT2.1蛋白的20種氨基酸中,Gly所占比例最高,為10.6 %;His所占比例最低,為1.5%。帶正電殘基(Arg+Lys)為39,負(fù)電殘基(Asp+Glu)為27。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為40.61,脂肪系數(shù)為89.11,親水性系數(shù)為0.402。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明,該蛋白很可能是位于質(zhì)膜上的膜蛋白。
二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明,氨基酸參與形成的α-螺旋(alpha helix)占63.21%,β-折疊(beta sheet)占3.4%,無規(guī)則卷曲(random coil)占33.4%。MeNRT2.1蛋白含有MFS蛋白保守結(jié)構(gòu)域,屬于MFS超級家族。通過TMHMM軟件進(jìn)行預(yù)測,依據(jù)氨基酸序列預(yù)測的NRT2.1拓?fù)鋱D(圖5)可以看出,該蛋白具有NRT2家族共有的結(jié)構(gòu)特征,有12個跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于NRT2蛋白,并且木薯NRT2.1蛋白氨基酸N-末端和C-末端分別位于細(xì)胞膜外和細(xì)胞膜內(nèi)。
2.3 MeNRT2.1蛋白序列比對及進(jìn)化分析
將MeNRT2.1氨基酸序列與其它植物的NRT2.1進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeNRT2.1與苜蓿(Medicago truncatula)、 擬南芥(Arabidopsis thaliana)、可可(Theobroma cacao)、 楊樹(Populus trichocarpa)等物種的NRT2.1的同源性分別為88%、81%、90%、89%。進(jìn)化樹分析表明,木薯MeNRT2.1氨基酸序列與可可樹TcNRT2.1的親緣關(guān)系最近(圖 6)。
2.4 MeNRT2.1在煙草原生質(zhì)體細(xì)胞中的瞬時表達(dá)
本研究構(gòu)建了以GFP為標(biāo)記的pC1302-MeNRT2.1載體,通過PEG介導(dǎo)的煙草原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)觀察目的基因融合蛋白的亞細(xì)胞定位,在激光共聚焦顯微鏡綠色熒光下觀察GFP熒光。如圖7所示,對照(空載體pC1302)的原生質(zhì)體細(xì)胞充滿綠色熒光,而pC1302-MeNRT2.1僅在細(xì)胞膜上出現(xiàn)GFP綠色熒光。結(jié)果表明該基因編碼的蛋白主要定位于細(xì)胞膜上,屬于跨膜轉(zhuǎn)運蛋白。
2.5 MeNRT2.1在木薯中的表達(dá)分析
為了研究在MeNRT2.1在木薯中的表達(dá)模式,采用實時熒光定量PCR對不同濃度硝酸鹽下木薯根、莖、葉中基因的表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果見圖8。由圖8可知,MeNRT2.1在組培苗的根中表達(dá),在莖、葉中幾乎不表達(dá),并且在NO3-濃度為0.2 mmol/L時表達(dá)量最高,NO3-濃度為10 mmol/L時其相對表達(dá)量較低,無NO3-時幾乎不表達(dá),即該基因具有誘導(dǎo)型組織特異性表達(dá)模式。同時,RNA-seq高通量測序結(jié)果與本研究qRT-PCR的結(jié)果相一致。
3 討論與結(jié)論
本研究根據(jù)擬南芥中已知的NRT2.1基因,利用同源克隆和RT-PCR技術(shù),獲得木薯中一個高親和硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運蛋白基因MeNRT2.1。該基因含有1 593 bp的CDS序列,編碼530個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,NRT2.1基因核苷酸及氨基酸序列與其他植物NRT2.1有較高的同源性,MeNRT2.1與可可樹[23]、楊樹[24]和苜蓿[25]的同源性分別高達(dá)90%、89%和88%,這與聚類分析的結(jié)果相一致,表明該基因可能為木薯NRT2.1基因,與其他植物中報道的NRT2.1基因具有相似的功能[11,13-16]。
研究已表明擬南芥AtNRT2.1基因?qū)ο鯌B(tài)氮信號反應(yīng)較快,在低濃度下短時間內(nèi)表達(dá)量可能達(dá)到峰值,然后恢復(fù)正常水平[26],并且AtNRT2.1的表達(dá)具有階段性,低濃度NO3-處理2、4、10 d時均有最大峰值出現(xiàn)[27],在木薯中可能具有類似的表達(dá)模式。但因木薯長期生長于貧瘠土壤中,本研究將木薯幼苗在不同濃度硝態(tài)氮中處理20 d,既保證了苗期植株發(fā)育的完整性,又符合木薯生理特征及自然生長環(huán)境。通過qRT-PCR、RNA-seq(另文發(fā)表)的表達(dá)模式分析可知,木薯MeNRT2.1基因能夠被低濃度的硝態(tài)氮(0.2 mmol/L NO3-)在根中誘導(dǎo)表達(dá),與已經(jīng)報道的煙草[14]、大豆[15]、平邑甜茶[28]等植物中的NRT2表達(dá)模式相似。MeNRT2.1在低濃度(0.2 mmol/L)的NO3-中相對表達(dá)量較高,在10 mmol/L的NO3-中相對表達(dá)量較低,可能受到高濃度NO3-的抑制,這與高親和轉(zhuǎn)運體系NRT2基因功能基本相似。不同環(huán)境中基因發(fā)揮不同的功能,有利于植物長期適應(yīng)氮貧瘠環(huán)境。
跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白具有12個跨膜區(qū),符合NRT2家族蛋白共有的跨膜結(jié)構(gòu)特征,原生質(zhì)體瞬時表達(dá)結(jié)果表明該蛋白位于質(zhì)膜上,為膜結(jié)構(gòu)蛋白。有研究結(jié)果表明,AtNRT2.1主要定位于擬南芥根皮層和表皮的質(zhì)膜上[11],孔敏等[16]也發(fā)現(xiàn)BcNRT2 定位于白菜細(xì)胞膜上。膜上的蛋白質(zhì)主要有載體蛋白、通道蛋白、蛋白受體以及與細(xì)胞活動有關(guān)的離子泵等,說明MeNRT2.1的編碼產(chǎn)物對于細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性或控制蛋白轉(zhuǎn)運具有一定的作用[29]。需進(jìn)一步優(yōu)化實驗條件,利用轉(zhuǎn)基因、蛙卵異源表達(dá)系統(tǒng)等技術(shù)對有關(guān)該基因編碼蛋白親和NO3-的分子機制及編碼蛋白在質(zhì)膜上發(fā)揮的轉(zhuǎn)運功能進(jìn)行深入研究。
本研究成功克隆木薯MeNRT2.1基因,并對其序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析,為深入認(rèn)識木薯耐低氮和氮素高效利用的理論機制提供了相關(guān)依據(jù),也為木薯NO3-吸收轉(zhuǎn)運積累機制的深入研究提供了理論參考。
參考文獻(xiàn)
[1] 黃 潔, 李開綿, 葉劍秋, 等. 中國木薯產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展研究與對策[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2006, 22(5): 421-426.
[2] Nguyen H, Schoenau J J, Nguyen D, et al. Effects of long-term nitrogen,phosphorus, and potassium fertilization on cassava yield and plant nutrient composition in north Vietnam[J]. Journal of Plant Nutrition, 2002, 25(3): 425-442.
[3] 鮮開梅, 王彥波, 苑育文, 等. 氮素在甜椒等蔬菜作物方面的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2006(7): 6-9.
[4] 吳 巍, 趙 軍. 植物對氮素吸收利用的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010(13): 75-78.
[5] 譚麗霞, 曾建華, 吳宇佳, 等. 木薯氮磷鉀肥優(yōu)化施用技術(shù)研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 39(12): 66-68.
[6] Chapman N, Miller T. Nitrate transporters and root architecture[M]//Geisler M,Venema K. Transporters and pumps in plant signaling. Berlin: Springer, 2011: 165-190.
[7] Lee R B, Clarkson D T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux[J]. The EMBO Journal, 1986, 37(185): 1 753-1 767.
[8] Tsay Y F, Chu C C, Tsai C B, et al. Nitrate transporters and peptide transporters[J]. Febs Letters, 2001, 581(12): 2 290-2 300.
[9] Crawford N M, Glass A D M. Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants[J]. Trends in Plant Science, 1998, 3(10): 389-395.
[10] Okamoto M, Vidmar J J, Glass A D M. Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana responses to nitrate provision[J]. Plant Cell Physoil, 2003, 44(3): 304-317.
[11] Wirth J, Franck Chopin, Véronique Santoni, et al. Regulation of root nitrate uptake at the NRT2.1 protein level in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(32): 23 541-23 552.
[12] Hu B, Wang W, Ou S, et al. Variation in NRT1.1B contributes to nitrate-use divergence between rice subspecies[J/OL]. Nature Genetics, 2015, doi: 10.1038/ng. 3337.
[13] 徐海榮, 谷俊濤, 路文靜, 等. 水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因OsTNrt2.1的編碼蛋白特征和表達(dá)[J]. 作物學(xué)報, 2007, 33(5): 723-730.
[14] Quesada A, Krapp A, Trueman L J, et al. PCR-identification of a nicotiana plumbaginifolia cDNA homologous to the high-affinity nitrate transporters of the crnA family[J]. Plant Molecular Biology, 1997, 34(2): 265-274.
[15] Amarasinghe B H, de Bruxelles G L, Braddon M, et al. Regulation of GmNRT2 expression and nitrate transport activity in roots of soybean(Glycine max)[J]. Planta, 1998, 206(1): 44-52.
[16] 孔 敏, 楊學(xué)東, 候喜林, 等. 白菜NRT2基因的克隆及表達(dá)模式分析[J]. 園藝學(xué)報, 2011, 38(12): 2 309-2 316.
[17] Vidmar J J, Zhuo D G, Siddiqi M Y, et al. Regulation of high-affinity nitrate transporter genes and high-affinity nitrate influx by nitrogen pools in roots of barley[J]. Plant Physiology, 2000, 123(1): 307-318.
[18] Quaggiotti S, Ruperti B, Borsa P, et al. Expression of aputative high-affinity NO3- transporter and of an H+-ATPasein relation to whole plant nitrate transport physiology in two maize genotypes differently responsive to low nitrogen availability[J]. Journal of Experiment Botany, 2003, 54(384): 1 023-1 031.
[19] 阮孟斌, 李文斌, 于曉玲, 等. 一種適用于多糖多酚植物的高質(zhì)量RNA快速提取方法[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2011, 32(9): 1 704-1 707.
[20] Earley K W, Haag J R, Pontes O, et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics[J]. The Plant Journal, 2006, 45(4): 616-629.
[21] Sheen J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts[J]. Plant Physiology, 2001, 127(4): 1 466-1 475.
[22] Yoo S D, Cho Y H, Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis[J]. Nature Protocols, 2007, 2: 1 565-1 572.
[23] Motamayor J C, Mockaitis K, Schmutz J, et al. The genome sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate genes regulating pod color[J]. Genome Biology, 2013, 14(6): r53.
[24] Bai H, Euring D, Volmer K, et al. The nitrate transporter (NRT)gene family in poplar[J]. Plos One, 2013, 8(8): e72-126.
[25] Pellizzaro A, Clochard T, Planchet E, et al. Identification and molecular characterization of Medicago truncatula NRT2 and NAR2 families[J]. Physiologia Plantarum, 2015, 154(2): 256-269.
[26] Laugier E, Bouguyon E, Mauriès A, et al. Regulation of high-affinity nitrate uptake in roots of Arabidopsis depends predominantly on posttranscriptional control of the NRT2.1/NAR2.1 transport system[J]. Plant Physiology, 2012, 158(2): 1 067-1 078.
[27] Krapp A, Berthom E R, Orsel M, et al. Arabidopsis roots and shoots show distinct temporal adaptation pattern towards N starvation[J]. Plant Physiol, 2011, 157(3), 1 255-1 282.
[28] 王新亮. 果樹根系硝態(tài)氮信號響應(yīng)關(guān)鍵基因的克隆與功能分析[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.
[29] 邢浩然, 劉麗娟, 劉國振. 植物蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位研究進(jìn)展[J]. 華北農(nóng)學(xué)報, 2006, 21(增刊): 1-6.
責(zé)任編輯:林海妹