姜珊多嬌 楊海

摘 要 植物組織培養(yǎng)是一個嚴格的無菌操作過程。外植體的選擇、分離、表面消毒，培養(yǎng)基及其操作工具的滅菌處理，接種室和超凈工作臺的滅菌處理、操作人員的消毒，無論哪個環(huán)節(jié)出現(xiàn)了差錯，都會導致組培材料的大量污染。消毒滅菌的成功也是組培實驗的根本保證?；诖耍?jīng)過大量實驗，總結(jié)出降低雜菌污染率的消毒滅菌方法，并使這套方案具有可操作性，能適應中學實驗室條件下的實驗要求，為其他組培實驗者提供借鑒。

關鍵詞 消毒；滅菌；培養(yǎng)基；植物組織培養(yǎng)

中圖分類號：Q813.1+2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.29.053

組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅為植物外植體的生長提供營養(yǎng)，也可能成為微生物滋生的溫床。當一塊植物組織被接種到培養(yǎng)基上后，就會變得很脆弱，微生物的大量繁殖會嚴重影響植物的生長，甚至引發(fā)死亡，所以在接種前一定要做好滅菌工作。但這一工作對實驗者的要求較高，筆者也是在實踐中反復探索才得出了一套較好的方案，并將它系統(tǒng)地整理出來，以供參考。

1 問題引導

在組織培養(yǎng)的實驗課中，首先進行的是胡蘿卜與非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)，因為是初次接觸這方面的實驗，缺乏經(jīng)驗，筆者并未重視消毒滅菌這一環(huán)節(jié)，并且無菌操作的動作也不是很規(guī)范和熟練，在操作細節(jié)中漏洞很多。當培養(yǎng)7 d后打開培養(yǎng)箱，發(fā)現(xiàn)大部分的培養(yǎng)基被雜菌污染。由于實驗的失敗，筆者開始重視消毒滅菌這一環(huán)節(jié)。利用這次發(fā)現(xiàn)的問題，分析總結(jié)雜菌污染的原因，并把該問題作為一個課題研究，在后續(xù)的實驗中，設計各種方案進行比較，觀察哪種方法能減少外植體的污染。筆者按照教材中的無菌操作要求，分析實驗過程的每一個細節(jié)，甚至包括操作動作中是否可能帶入雜菌。將可能導致實驗失敗的各細節(jié)分析清楚后，同時查找資料，又提出一些解決辦法，重新設計了實驗方案，重新實驗。

2 探索中得出方案

接下來要進行的是蘆薈組織培養(yǎng)。這次實驗前，針對蘆薈組織的結(jié)構(gòu)特征進行了分析，并討論出以下消毒滅菌的方案。

2.1 關于植物材料

第一步：將植物置于流動的無菌水下沖洗。由于時間關系及條件限制，這一步筆者并沒有在實踐中應用，但可作為初步清洗方案。注意：節(jié)約用水，做好廢水的再次利用工作。

第二步：去除植物材料中的枯爛部分，選取健康飽滿的部位用牙刷進行刷洗。注意：第一，刷洗過程中要注意力道，不要太過用力導致植物材料遭到破壞，以致接種后無法存活，最好使用軟毛牙刷，刷洗時要反復多次，徹底清除污物；第二，刷洗過程中要勤換水；第三，有些植物有刺，可先剪掉刺再刷洗。

第三步：將植物按表1中的順序進行消毒。注意：第一，酒精會損傷植物，因此在酒精中的浸泡時間不能超過10 s；第二，B和C可互換順序；第三，以上3個消毒步驟之間，需要將植物材料放在無菌水中清洗，以洗去表面的殘留藥品。

第四步：以上3步完成后，立即將植物浸泡于無菌水中，并放入已滅菌過的超凈工作臺中。

2.2 培養(yǎng)基的滅菌處理

錐形瓶：用刷子將錐形瓶徹底刷洗干凈；培養(yǎng)基：將已配制好的培養(yǎng)基倒入錐形瓶中并封好口后，放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行滅菌，按照操作程序操作，在達到壓力要求后滅菌20 min即可實現(xiàn)徹底滅菌的效果。滅菌完成后，要立即把培養(yǎng)基從高壓蒸汽滅菌鍋中取出，并放入已滅菌后的超凈工作臺中。取出時要佩戴棉手套，以免燙傷。

2.3 操作臺和操作間的消毒與滅菌

超凈工作臺：在將材料、培養(yǎng)基、工具等實驗操作中所用到的物品放入超凈工作臺前，用酒精棉對操作臺進行消毒處理，并且與接種室一起用紫外線燈滅菌。

接種室：在實驗前20 min，打開超凈工作臺的紫外線燈與無菌風幕，并且實驗所用到的物品此時也都放進超凈工作臺中，在紫光燈下滅菌處理。準備就緒后進入接種室。注意：第一，紫外線對人體有害，在紫光燈照射期間，人不能停留在接種室內(nèi)，紫外線照射會使空氣中產(chǎn)生刺激性氣味的臭氧，將紫光燈關閉并開啟風幕一段時間后，實驗人員方可進入；第二，紫外線對植物也有傷害，甚至誘導植物發(fā)生變異，如果此時植物材料已放入超凈工作臺，應將植物遮蓋。

2.4 其他環(huán)節(jié)

操作工具：操作工具插在電子加熱滅菌器（280 ℃）中進行滅菌。注意：第一，滅菌器的溫度達到280 ℃以上才可達到對操作工具的滅菌效果；第二，因為操作工具是插在滅菌器中，因此其尾部還應用酒精棉仔細擦拭；第三，滅菌器一直放于超凈工作臺中，所以擦拭操作臺時也應將滅菌器擦拭干凈。

操作者：第一，穿經(jīng)消毒的醫(yī)用白大褂進入接種室；第二，穿拖鞋進入接種室；第三，佩戴醫(yī)用無菌手套及口罩（手套可再用酒精擦拭幾遍）。注意：白大褂和拖鞋使用前要在接種室用紫外線滅菌處理。

3 效果反饋

按照以上方案進行了蘆薈組織培養(yǎng)實驗，接種幾天后進行觀察，發(fā)現(xiàn)了被污染的瓶數(shù)明顯減少了許多。這說明以上消毒滅菌的方案有一定的效果，但又出現(xiàn)了一些其他問題，如有些植物組織出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，原因可能是消毒過度。因此，消毒滅菌的方法還需要繼續(xù)探索。

后記：在組培實驗中，不僅消毒滅菌過程要小心謹慎，其他環(huán)節(jié)也同樣如此。組培的周期很長，植物組織過了消毒這一關，也只是邁出了一小步，它的生長歷程還需要更加精心的呵護。

指導教師評價：該同學在本實驗小組研究雜菌污染因素的基礎上，總結(jié)了組培實驗室組培實驗過程中消毒滅菌的方法。本文以牡丹江市第一高級中學組培室現(xiàn)有條件為背景，總結(jié)內(nèi)容科學、嚴謹，方法實用，值得借鑒，特別適合本校組培室使用。該同學熱愛學習，熱愛組培實驗，理論知識扎實、組培操作熟練、實驗研究的熱情高、動手能力強，善于總結(jié)經(jīng)驗。希望該同學能始終保持這種熱情，也希望通過高中階段的組培實驗，對該同學將來個人發(fā)展能有所幫助。

（責任編輯：趙中正）