肖小虎　隋金蕾　戚繼艷　方永軍　王闖　唐朝榮

摘 要 膜聯(lián)蛋白是一個多基因家族，在植物逆境脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育等方面起重要作用。本研究以已發(fā)表的膜聯(lián)蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹和其他5種植物的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行搜索，鑒定得到14個橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族成員，命名為AnnHb1-AnnHb14。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，14個家族成員的內(nèi)含子數(shù)目為3～6個，結(jié)構(gòu)域的數(shù)目為2～4個。在進(jìn)化上，橡膠樹、木薯和蓖麻共3種大戟科植物的膜聯(lián)蛋白具有較近的親緣關(guān)系。表達(dá)方面，AnnHb1在各組織中普遍表達(dá)，而AnnHb6和AnnHb7主要在膠乳中表達(dá)，AnnHb10、AnnHb8和AnnHb13分別在樹葉、樹皮和雄花中特異表達(dá)，其他成員在各組織中低豐度表達(dá)或不表達(dá)；部分家族成員的表達(dá)還與葉片發(fā)育、乙烯利刺激、真菌侵染和低溫脅迫等具有一定相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；膜聯(lián)蛋白；基因家族；結(jié)構(gòu)和進(jìn)化；表達(dá)分析

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

膜聯(lián)蛋白（Annexins）是一類Ca2+及磷脂結(jié)合型蛋白，廣泛存在于真核生物中，在進(jìn)化上是相對保守的多基因家族。早期對膜聯(lián)蛋白的研究主要是針對動物，研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白參與調(diào)節(jié)動物細(xì)胞的多種生理生化過程[1-2]。1989年Boustead等[3]首次報道在高等植物中發(fā)現(xiàn)了膜聯(lián)蛋白，隨后有關(guān)學(xué)者陸續(xù)從玉米、豌豆、棉花等多種植物中得到了膜聯(lián)蛋白[4-6]。2000年Hofmann等[7]利用X-射線衍射晶體學(xué)及多種生物物理學(xué)方法首次闡明了辣椒的Annexin三維結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，植物膜聯(lián)蛋白參與植物分泌作用、胞吐作用和低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)功能[4，5，8]。近年來，隨著植物基因組測序的進(jìn)行，相關(guān)學(xué)者從多種植物中鑒定出膜聯(lián)蛋白基因家族成員，并對家族成員的表達(dá)進(jìn)行了分析，如擬南芥、番茄、水稻等[9-11]。但是關(guān)于膜聯(lián)蛋白在橡膠樹、木薯等大戟科植物中的研究卻未見報道。本研究以已發(fā)表的膜聯(lián)蛋白氨基酸序列為探針，對橡膠樹、木薯、蓖麻、擬南芥、楊樹和水稻等6種植物的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全面搜索，鑒定得到65個膜聯(lián)蛋白基因家族成員，其中包括14個橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因；并利用相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對這些家族成員的基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和表達(dá)水平進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究結(jié)果將有助于深入了解橡膠樹膜聯(lián)蛋白的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室Solexa測序所用的巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）為熱研7-33-97，根取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所種質(zhì)資源圃華玉偉老師贈送的熱研7-33-9組培苗，其他組織（包括膠乳、樹皮、樹葉、種子、雌花和雄花）均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊的正常割膠橡膠樹（開割2年以上）；不同發(fā)育時期的橡膠樹葉片取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所種質(zhì)資源圃一年生的熱研7-33-97嫁接苗；乙烯利處理的材料主要取自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場三隊熱研7-33-9正常開割樹（3天一刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同時間處理橡膠樹，相應(yīng)4個處理時間點為0 h、3 h 、12 h和24 h ，具體實驗步驟參照肖小虎[12]的方法進(jìn)行。

網(wǎng)上測序數(shù)據(jù)來自NCBI SRA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra），包括不同組織（PRJNA201084）、真菌侵染（Corynespora cassiicola tolerance，PRJNA179126）、高低溫干旱脅迫（PRJNA182078）和乙烯利處理（PRJNA182079）等數(shù)據(jù)，詳細(xì)信息參見數(shù)據(jù)庫中實驗說明。

1.2 方法

1.2.1 基因家族成員的鑒定與序列分析 為了全面鑒定橡膠樹、擬南芥、楊樹、水稻、木薯和蓖麻的膜聯(lián)蛋白基因家族成員，筆者從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫下載了6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；以已發(fā)表的膜聯(lián)蛋白序列為探針，對6種植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行搜索，得到候選膜聯(lián)蛋白基因家族成員；利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）對候選基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；再利用EMBOSS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Pepstats（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/）對基因的等電點和分子量進(jìn)行批量分析。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析 利用在線軟件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對橡膠樹和其他5種植物膜聯(lián)蛋白基因家族成員的外顯子/內(nèi)含子組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建橡膠樹和其他5種植物膜聯(lián)蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-Joining方法分析分子系統(tǒng)學(xué)，進(jìn)行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗。

1.2.3 基因的表達(dá)模式分析 利用本實驗室和NCBI的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析[13]：首先，將NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中橡膠樹相關(guān)的solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載到本地服務(wù)器，去除低質(zhì)量序列，利用程序RSEM進(jìn)行表達(dá)分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜聯(lián)蛋白基因家族成員的鑒定與序列分析

本研究利用tblastn搜索各植物轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，共鑒定得到了65個膜聯(lián)蛋白（表1），其中橡膠樹14個，命名為AnnHb1～AnnHb14。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹膜聯(lián)蛋白含234～342個氨基酸，分子量為27～39 ku，等電點在6.3～9.6，內(nèi)含子數(shù)目為3～6個。氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，橡膠樹膜聯(lián)蛋白含有多個保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

對橡膠樹和其他5種植物annexin基因的外顯子/內(nèi)含子的組織結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一進(jìn)化分支上的家族成員在內(nèi)含子數(shù)目和相對位置上以及結(jié)構(gòu)域的相對位置上具有一定的相似性，如AnnMe9、AnnHb5、AnnRc7、AnnHb1、AnnMe6和AnnPt3聚在同一個分支，都含有5個內(nèi)含子，其內(nèi)含子和結(jié)構(gòu)域的相對位置都非常一致； 也有一些分支存在較大差異，如AnnOs1和AnnOs6聚在同一個分支，其中AnnOs1僅有2個內(nèi)含子，而AnnOs6含有5個內(nèi)含子。在進(jìn)化上，橡膠樹annexin基因主要和木薯、蓖麻annexin基因聚在一起，這與此3種大戟科植物具有較近的親緣關(guān)系的結(jié)論一致。

2.3 橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族成員的表達(dá)分析

本實驗室Solexa轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，AnnHb1在所檢測的組織中都普遍表達(dá)，在葉片發(fā)育過程中呈下調(diào)表達(dá)，而在乙烯利處理后的不同時間點呈上調(diào)表達(dá)；AnnHb10主要在葉片中表達(dá)，并且在葉片穩(wěn)定期的表達(dá)要高于其他時期；AnnHb6和AnnHb7主要在膠乳中高豐度表達(dá)，并且AnnHb7在乙烯利處理后有一定的下調(diào)表達(dá)趨勢；AnnHb8和AnnHb13分別在樹皮和雄花中表達(dá)；其他家族成員，如AnnHb2、AnnHb3、AnnHb4、AnnHb9、AnnHb11、AnnHb12和AnnHb14在各組織中的表達(dá)豐度都很低或不表達(dá)（圖3）。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖4）表明，AnnHb1在所分析的各組織中普遍表達(dá)，這和本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果一致，在真菌C. cassiicola侵染的葉片中AnnHb1上調(diào)表達(dá)。AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7分別在樹皮、樹葉和膠乳中高豐度表達(dá)，其中AnnHb10在C. cassiicola侵染后下調(diào)表達(dá)，AnnHb7在乙烯利處理后下調(diào)表達(dá)。另外，AnnHb2在低溫脅迫下呈下調(diào)表達(dá)，其它基因在所檢測樣品中低豐度表達(dá)或不表達(dá)。

從以上2部分實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果來看，橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族成員的表達(dá)分為3種類型：第一種類型為普遍表達(dá)，如AnnHb1在各組織中均有表達(dá)，并且表達(dá)豐度也較高；第二種類型為組織特異性表達(dá)，如AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7分別在樹皮、樹葉和膠乳中特異表達(dá)；第三種類型為低豐度表達(dá)或不表達(dá)，如AnnHb4、AnnHb9、AnnHb11、AnnHb12等。從分析結(jié)果可以看出，橡膠樹膜聯(lián)蛋白的表達(dá)與橡膠樹的生長發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答都有一定的相關(guān)性。另外，通過對2部分實驗的結(jié)果進(jìn)行比較可以看出，2部分實驗結(jié)果非常一致，這也說明本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 討論與結(jié)論

早期對膜聯(lián)蛋白的研究主要集中于動物細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白對動物的分泌過程有一定的調(diào)節(jié)作用[1]。因而對植物膜聯(lián)蛋白的研究早期也集中在分泌型細(xì)胞，隨著功能研究的進(jìn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白在植物生長發(fā)育調(diào)控和環(huán)境適應(yīng)方面扮演重要角色。在擬南芥中，膜聯(lián)蛋白基因家族成員有8個（AnnAt1～AnnAt8），研究發(fā)現(xiàn)這些成員在多種脅迫處理下表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，大部分基因受鹽、干旱、脫落酸（ABA）以及高低溫脅迫的誘導(dǎo)[15]。Breton等[16]在耐寒型小麥中發(fā)現(xiàn)2種可響應(yīng)低溫脅迫且不依賴于Ca2+的膜聯(lián)蛋白基因。白楊葉片受低溫脅迫可誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白基因的上調(diào)表達(dá)[16-17]。利用本實驗室和NCBI已有Solexa數(shù)據(jù)，筆者對14個橡膠樹膜聯(lián)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)AnnHb1在各組織中普遍表達(dá)，推測該基因在進(jìn)化上功能相對比較保守；AnnHb8、AnnHb10、AnnHb6和AnnHb7呈組織特異性表達(dá)，推測這些基因在進(jìn)化過程中發(fā)生變異，在特異組織發(fā)揮功能。AnnHb7在乙烯利處理后下調(diào)表達(dá)，AnnHb1在真菌C. Cassiicola侵染的葉片中上調(diào)表達(dá)，而AnnHb10在C. Cassiicola侵染后下調(diào)表達(dá)，AnnHb2在低溫脅迫下呈下調(diào)表達(dá)。從分析結(jié)果可以看出，橡膠樹膜聯(lián)蛋白的表達(dá)與橡膠樹的生長發(fā)育以及逆境脅迫應(yīng)答都有一定的相關(guān)性，這與已有研究中所述膜聯(lián)蛋白的功能一致。本研究首次利用Solexa高通量數(shù)據(jù)對橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族的表達(dá)進(jìn)行分析，本實驗室和NCBI數(shù)據(jù)的一致性證明了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，本實驗室的高通量數(shù)據(jù)已成功應(yīng)用于橡膠樹基因組數(shù)據(jù)分析以及橡膠樹蔗糖合成酶基因家族相關(guān)分析，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在Nature Plants[18]和 Febs Journal[13]，這進(jìn)一步證實了本研究數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，網(wǎng)上可利用的高通量數(shù)據(jù)越來越豐富，利用這些數(shù)據(jù)對全基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)的分析，將為后續(xù)基因功能研究打下基礎(chǔ)。本研究首次鑒定了14個橡膠樹膜聯(lián)蛋白基因家族成員，并對其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，研究結(jié)果將有助于深入了解膜聯(lián)蛋白在橡膠樹生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答過程中所起的作用，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

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