莫倩珍　劉靜

摘要：科學研究的需要，使得倒置熒光顯微鏡在醫(yī)學科研型研究生實驗教學中的使用越來越普遍，因此正確使用和妥善管理顯得尤為重要。本文從使用與管理角度加以討論，總結(jié)了使倒置熒光顯微鏡更好地為實驗教學服務(wù)的方法。

關(guān)鍵詞：倒置熒光顯微鏡；實驗教學；正確使用；妥善管理

中圖分類號：G647 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）16-0261-02

倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，其由倒置顯微鏡和落射熒光裝置組成，具有在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶內(nèi)進行顯微觀察的特點，可實現(xiàn)活體細胞和組織、流質(zhì)、沉淀物等的相差、熒光觀察是科學研究工作中的理想儀器。所以，在醫(yī)學科研型研究生的實驗教學中，掌握倒置熒光顯微鏡的使用至關(guān)重要，只有正確的使用和妥善的管理倒置熒光顯微鏡，才能發(fā)揮它的功能和提高使用率，使之更好地為實驗教學和科學研究服務(wù)。

一、倒置熒光顯微鏡的正確使用

倒置熒光顯微鏡是用于高端生物科學研究領(lǐng)域的多功能顯微鏡，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且價格昂貴，因此，要想醫(yī)學研究生正確掌握倒置熒光顯微鏡的操作使用規(guī)范，教師得首先在示范倒置熒光顯微鏡的實際操作之前，開設(shè)學習倒置熒光顯微鏡基本知識的課程，介紹倒置熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理、功能和基本使用方法，再在具體的使用操作中，針對不同的標本，示范不同的功能，由淺入深，逐漸使醫(yī)學研究生對倒置熒光顯微鏡的操作使用規(guī)范化。

1.明視野觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之一是明視野觀察，其基本原理是標本經(jīng)光線照射后，各部分對光吸收的不同而在明亮的背景中實現(xiàn)成像，主要適用于經(jīng)染色或本身具有顏色的細胞、組織切片等標本的觀察。其基本步驟為：①打開外置白光電源供電器開關(guān)和倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開關(guān)；②通過倒置熒光顯微鏡的左側(cè)光強調(diào)節(jié)旋鈕，調(diào)整到合適的照明亮度；③確認照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進光路；④旋轉(zhuǎn)倒置熒光顯微鏡右側(cè)的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調(diào)節(jié)目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉(zhuǎn)聚光鏡轉(zhuǎn)盤，將“A”檔移入光路；⑦放置切片標本，通過旋轉(zhuǎn)對焦手輪對標本進行聚焦；⑧用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標本。明視野觀察是所有顯微鏡具備的功能，普通應(yīng)用于科學研究中。醫(yī)學研究生由于本科畢業(yè)于不同的院校，文化背景參差不齊，對顯微鏡的掌握程度不同，因此教師在實驗教學過程中很有必要再次向他們灌輸良好的使用習慣。另外，還要向他們講解常見問題出現(xiàn)時應(yīng)采取的策施。例如，接通電源開關(guān)而燈不亮時，可檢查亮度控制按鈕是否打開、電源線是否接觸良好、燈泡是否燒壞；視場圖像模糊時，可通過逐步移動物鏡、目鏡和載玻片來尋找原因；旋轉(zhuǎn)亮度調(diào)節(jié)旋鈕而亮度無變化時，可檢查控制線是否正確連接。

2.相差觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之二是相差觀察，其基本原理是將樣本不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹睿?jīng)過帶有相位片的相差物鏡和帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡實現(xiàn)觀測，主要適用于活細胞或不染色的組織切片觀察。其基本步驟為：①打開外置白光電源供電器開關(guān)和倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開關(guān)；②通過倒置熒光顯微鏡的左側(cè)光強調(diào)節(jié)旋鈕，調(diào)整到合適的照明亮度；③確認照明支柱上方的NCB11、ND、D濾光片推進光路；④旋轉(zhuǎn)倒置熒光顯微鏡右側(cè)的旋鈕，使光路處于“EYE”位置；⑤調(diào)節(jié)目鏡筒瞳距和屈光度；⑥旋轉(zhuǎn)聚光鏡轉(zhuǎn)盤，將合適的相差環(huán)轉(zhuǎn)入光路（4X對應(yīng)PHL，10X/20X對應(yīng)PH1，40X對應(yīng)PH2）；⑦放置細胞標本，通過粗微調(diào)機構(gòu)對標本對焦；⑧用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標本。在實驗教學過程中，除了正確引導(dǎo)醫(yī)學研究生遵守相差觀察的基本操作方法，同時更為重要的是引導(dǎo)他們對使用相差觀察的標本認識和掌握。對他們來說，在日后的科學研究中，最為常用的是培養(yǎng)細胞的顯微觀察。但是學生在初入研究生階段，可能對培養(yǎng)細胞的器材和細胞形態(tài)沒有完整的認識，甚至都未真正接觸，從而不能完全找到正確的視野和正確掌握相差觀察的使用。這就要求教師在教學過程中明確地為研究生講解細胞標本的制備方法，并告訴他們在觀察時應(yīng)注意的問題。首先，對于細胞器材的選擇，一般建議使用玻璃材質(zhì)和塑料材質(zhì)的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶。它們多為無色透明，可直接在倒置熒光顯微鏡上進行觀察，不用倒掉細胞液和經(jīng)過其他處理。其次，在進行顯微觀察中，不要隨意打開器材的蓋子，以免污染細胞。最后，對于操作人員來說，需佩戴手套、口罩和白大衣，不僅可以保護自身健康而且可以防止細胞污染。

3.熒光觀察的正確使用。倒置熒光顯微鏡的功能之三是熒光觀察，其基本原理是利用激發(fā)光激發(fā)樣本產(chǎn)生熒光，從而實現(xiàn)樣本的形狀與定位觀察，主要適用于熒光標記樣本的觀察。其基本步驟為：①通過相差觀察步驟找到標本對焦；②打開外置熒光供電器電源開關(guān)，長按激發(fā)按鈕激發(fā)汞燈；③通過關(guān)閉倒置熒光顯微鏡左側(cè)的白色按鈕開關(guān)來關(guān)閉白光；④確認熒光的視場光闌、孔徑光闌、供電器上的SHUTER光閘全部打開；⑤確認熒光供電器上的ND旋鈕在1位置、熒光濾色塊轉(zhuǎn)盤上的熒光光閘在O位置；⑥旋轉(zhuǎn)熒光濾色塊轉(zhuǎn)盤，使合適的熒光濾光塊進入光路；⑦用所需的放大倍數(shù)物鏡觀察標本。熒光觀察是倒置熒光顯微鏡的重要功能，其配件昂貴且使用特殊。要想醫(yī)學研究生正確地掌握熒光觀察的操作使用規(guī)范，教師除了教會他們掌握基本的操作方法，同時更為重要的是教會他們掌握它的特殊性。首先，在標本制作中，載玻片和蓋玻片應(yīng)表面光潔且厚度適宜（載玻片在0.8mm～1.2mm之間，蓋玻片在0.17mm左右）；標本應(yīng)厚度適宜，同時避免細胞重疊或雜質(zhì)掩蓋；封裱劑應(yīng)使用甘油和碳酸鹽緩沖液（0.5mol/L PH9.0～9.5）的等量混合液。其次，在熒光觀察前，應(yīng)關(guān)閉房間內(nèi)的電燈和倒置熒光顯微鏡的白光，確保處于暗室環(huán)境。最后，在熒光觀察中，應(yīng)嚴格控制觀察時間，一般以1～2小時/次為宜，否則熒光會出現(xiàn)衰減和消失的現(xiàn)象；調(diào)整光源時應(yīng)佩戴防護眼鏡，避免紫外線對眼鏡的傷害。

4.圖像拍攝的正確使用。在科學研究中，不僅要求倒置熒光顯微鏡可以實現(xiàn)多種觀察，而且要求倒置熒光顯微鏡可以實現(xiàn)圖像拍攝。倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)通過光電轉(zhuǎn)換將光學顯微鏡與計算機結(jié)合在一起，不僅可以在目鏡上進行顯微觀察，而且可以在計算機上進行實時動態(tài)圖像的觀察、編輯和保存。其基本步驟為：①打開電腦，插入軟件加密鎖；②打開桌面軟件NIS-ELEMENTS；③倒置熒光顯微鏡的顯微鏡右側(cè)旋鈕，使光路切換至“L”位置，即光路進入相機；④點擊“預(yù)覽圖標”，顯示live實時圖像；⑤選擇合適的曝光時間和合適的拍照區(qū)域；⑥點擊“標本圖標”，確認當前物鏡倍數(shù)是否與軟件一致；⑦點擊拍照按鈕，保存圖像。在實驗教學中，教師除了教會醫(yī)學研究生正確使用倒置熒光顯微鏡的三種觀察，還要教會他們?nèi)绾问褂门恼蘸途庉嫻δ堋６谂恼罩?，?yīng)重點強調(diào)光路的切換。根據(jù)以往的教學經(jīng)驗，總發(fā)現(xiàn)不少研究生未將光路切換至“L”位置就直接進行拍照。另外，還要強調(diào)軟件加密鎖的重要性，告誡他們千萬不要損壞和丟失，因為它不僅價格昂貴，而且是圖像拍攝和數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵。

二、倒置熒光顯微鏡的維護與管理

1.倒置熒光顯微鏡的維護。首先，在使用倒置熒光顯微鏡前，應(yīng)檢查儀器是否良好、環(huán)境是否清潔干燥、儀器是否無振動和磁場干擾以及無陽光或紫外消毒燈照射。確認無誤后，輕輕掀開防塵罩，在固定的位置上進行觀察，不要輕易搬動。同時，操作人員與倒置熒光顯微鏡應(yīng)保持一定的距離，以免發(fā)生撞碰。其次，在使用倒置熒光顯微鏡過程中，應(yīng)當嚴格遵守各個功能的操作使用規(guī)范，正確掌握開機順序（先開顯微鏡，再開相機電源，最后開電腦）和關(guān)機順序（先關(guān)電腦，再關(guān)相機電源，最后關(guān)顯微鏡），做到不使用熒光不開啟熒光光源、不拍照不開啟電腦；注意避免頻繁開關(guān)熒光燈，接通電源和關(guān)閉電源的間隔時間不少于30分鐘，以保證熒光汞燈的正常使用壽命；禁止在系統(tǒng)電腦上連接網(wǎng)線和插入U盤或移動硬盤，以免電腦中毒；不得隨意拆取物鏡、目鏡、熒光濾色片等光學部件，不得隨意調(diào)節(jié)對中旋鈕以免使光路產(chǎn)生偏差，不得大角度曲折熒光光纖以保持自然彎曲，不得使用暴力操作各儀器部件，不得在電源接通或開啟情況下打開燈箱更換燈泡。最后，使用倒置熒光顯微鏡結(jié)束后，除熒光觀察外，應(yīng)及時關(guān)掉電源，使用乙醚和無水乙醇的混合液（摻和比例為7∶3）擦拭光學表面，保持倒置熒光顯微鏡的干燥和清潔；不得使用鏡頭紙以外的硬物擦拭鏡頭以免損壞鏡頭鍍膜；若使用圖像拍攝功能，應(yīng)正確退出軟件加密鎖后，再按正確程序關(guān)閉電腦；燈箱冷卻后方可蓋上防塵罩，以免燒壞儀器和發(fā)生火災(zāi)。

2.倒置熒光顯微鏡的管理。由于醫(yī)學研究生眾多，而倒置熒光顯微鏡稀少，因此妥善的管理顯得尤為重要。它不僅可以防止倒置熒光顯微鏡的損壞，而且可以提高倒置熒光顯微鏡的使用率。我們可以采取以下管理方案：①先學后用制，即研究生先經(jīng)過課堂和實驗教學的學習，正確掌握使用方法后才可以使用；②使用登記制，即研究生使用后，需詳細記錄使用情況，記錄中應(yīng)包括使用時間、使用人員、使用哪種功能和儀器有無異常，具有可追溯性；③專人管理制，即設(shè)定專門的管理人員，負責儀器的保管，負責儀器的使用安排，定期對儀器進行檢查和保養(yǎng)；④檔案設(shè)定制，即由儀器管理人員建立儀器檔案，內(nèi)容主要包括使用說明書、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)日期、購置日期、維護和維修記錄等。

參考文獻：

[1]程靜華，李平，容哲.形態(tài)實驗教學中顯微鏡存在的問題及處理[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2009，30（10）：121-122.

[2]嚴家來，方安寧，陳雨京.課堂實驗教學中生物光學顯微鏡使用的不規(guī)范操作及正確做法[J].高教高職研究，2015，（67）：156.