江潔曙　王珊珊　方晶晶

[摘要] 目的 觀察TIPE2穩(wěn)定沉默后對TLR激動劑Poly I：C誘導THP-1凋亡的影響。 方法 以THP-1細胞為研究對象，使用不同TLR激活劑與THP-1細胞孵育后，采用熒光定量PCR檢測TIPE2 mRNA表達。應用慢病毒技術穩(wěn)定沉默TIPE2表達后，MTT法檢測細胞增殖，Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡，免疫印跡分析TIPE2沉默后Caspase-8表達水平變化。 結果 TLRs激活劑中TLR3特異性激活劑Poly I：C可以顯著上調TIPE2的表達（P<0.05），隨作用時間延長，可顯著抑制THP-1細胞增殖，并可誘導細胞凋亡。利用慢病毒技術穩(wěn)定沉默THP-1細胞中TIPE2表達以后，可顯著削弱Poly I：C誘導的TIPE2表達（P<0.05），TIPE2沉默后，Poly I：C抑制THP-1增殖和誘導細胞凋亡的效應顯著削弱，隨后免疫印跡的結果顯示，Caspase-8的活化形式，p41/42表達下調。 結論 Poly I：C通過上調TIPE2表達可抑制THP-1細胞增殖，并可誘導細胞凋亡，穩(wěn)定沉默TIPE2后可一定程度削弱上述效應，可能與下調Caspase-8的活性形式表達有關。

[關鍵詞] Poly I：C；TIPE2；免疫；TLR；凋亡

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）16-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of stably silent TIPE2 on THP-1 apoptosis induced by TLR agonist Poly I：C. Methods THP-1 cells were selected as the study subjects. The expression of TIPE2 mRNA was detected by fluorogenic quantitative PCR after incubation of THP-1 cells with different TLR activating agents. After stable silence of TIPE2 by lentiviral technique， the cell proliferation was detected by MTT， apoptosis was detected by Annexin V/PI double-staining method， and changes of Caspase-8 expression level after silence of TIPE2 was analyzed by western blot. Results TLR3 specific activator Poly I：C could significantly up-regulate the expression of TIPE2（P<0.05）. Along with the time of action， it could significantly inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis. Stable silence of TIPE2 in THP-1 by lentiviral technique could significantly impair the TIPE2 expression induced by Poly I：C （P<0.05）. After silence of TIPE2， the effects of Poly I：C on inhibition the proliferation of THP-1 and induction of apoptosis were significantly impaired， and the result of following western blot showed active form of Caspase-8 and down-regulation of p41/42 expression. Conclusion By up-regulating the expression of TIPE2， Poly I：C can inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis， which can be partially impaired by stable silence of TIPE2， possibly due to down-regulation of Caspase-8 active form expression.

[Key words] Poly I：C； TIPE2； Immune； TLR； Apoptosis

免疫系統(tǒng)內穩(wěn)態(tài)的維護機制極其復雜和神秘，改變調控免疫細胞死亡或者活化擴增免疫細胞均可以打破免疫細胞的內穩(wěn)態(tài)環(huán)境，最終帶來極為致命的炎性疾病，目前研究發(fā)現(xiàn)一組超家族蛋白對免疫系統(tǒng)的內穩(wěn)態(tài)維持至關重要。尤其是具有hexahelical bundle 結構的蛋白稱之為死亡效應domain（DED），與Caspase家族蛋白的CARD結構域以及募集區(qū)域有結構類似，參與到細胞死亡和其他的信號通路中。

TIPE中壞死因子誘導蛋白8-類似蛋白2作為這類家族蛋白的成員之一，近年來，在機體免疫的內穩(wěn)態(tài)中扮演重要作用，其主要機制與調控T細胞受體和Toll樣受體信號通路有關，除了在炎癥組織中表達外，TIPE2還在髓樣組織和多種腫瘤細胞中表達，說明其中可能發(fā)揮著不同的功能[1]。有報道顯示，TIPE2可以調控Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）的表達，并對周圍不同的刺激信號強度產生響應[2]。但是上游TLR的活化是否也可以影響TIPE2的表達，是否可以影響人單核/巨噬細胞活性和增殖？尚未見有相關的報道。本項目于2014年1月～2015年12月期間，以人單核細胞株THP-1為考察對象，考察不同TLR激動劑對TIPE2表達的影響，并探討相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和TLR激動劑處理

人THP-1細胞購自中國科學院上海細胞庫。新生牛血清，DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自美國Life technology公司；人TLR1-9激動劑購自InvivoGen公司，抗人TIPE2和Caspase-8抗體購自Abcam公司。其余試劑均為國產分析純。THP-1細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青-鏈霉素霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含有5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中，每隔2～3天換液。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞計數(shù)后將試劑盒中的TLR1-9特異性激動劑用培養(yǎng)液稀釋后使用，終濃度分別為0.1 μg/mL和1 μg/mL，孵育24 h后，Trizol裂解細胞，提取RNA，按照方法1.6中的描述檢測TIPE2 mRNA表達水平。

1.2細胞抑制實驗

細胞抑制率使用四甲基偶氮噻唑藍法（methlthiazoletrazolium assay，MTT assay），將THP-1細胞以1×104/mL密度接種于6孔或12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，Poly I：C配置成10 mg/mL儲液，使用時用完全培養(yǎng)稀釋，加入到細胞中使得終濃度分別為0.1 μg/mL、1 μg/mL，設置空白對照組。于24 h后收集細胞，加入5 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h后，棄上清每孔加150 μL DMSO后在酶標儀上570 nm處讀取吸光值（OD）。實驗重復3次。計算抑制率=（1-ODPloyI：C/OD空白對照組）×100%。穩(wěn)定沉默TIPE2后的細胞抑制率基本方法同上，實驗前1 d細胞按1×104/孔鋪96孔板，設shTIPE2穩(wěn)定沉默組（經過嘌呤霉素篩選后穩(wěn)定沉默TIPE2的THP-1細胞），shScramble組（經過嘌呤霉素篩選后的空白載體組），加入Poly I：C后孵育24 h后加入MTT檢測細胞在570 nm處的吸光度值變化。

1.3慢病毒載體構建以及穩(wěn)定沉默TIPE2細胞株建立

退火形成雙鏈DNA片段。與雙酶切線性化后的pLKO.1-TRC載體（含GFP編碼序列）連接。取4 μL所得的連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取3個單克隆菌落接種至Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，小搖過夜。用試劑盒小量提取質粒后，分別用EcoRI和NcoI酶切鑒定，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。鑒定正確的質粒命名為：pLKO.1-TRC-TIPE2-shRNA1。將酶切鑒定正確的細菌送測序以進一步確認序列。

病毒包裝時，轉染前1 d對293T細胞進行分皿。使用脂質體轉染法將含shTIPE2或shScramble質粒，分別同pΔ8.91及pMD2.G這2個包裝質粒按照10∶10∶1的質量比混合后，共轉染293T細胞。12 h后更換完全培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。48～72 h期間收集上清，0.45 μm濾器過濾后備用。感染時，取對數(shù)生長期THP-1細胞，接種于6孔板培養(yǎng)12 h后，棄上清每孔滴加含病毒液體200 μL，加入含polybrene（濃度4 μg/mL）的培養(yǎng)基，感染8 h后換普通培養(yǎng)基；48 h后加含嘌呤霉素（濃度0.5 μg/mL）的培養(yǎng)基，隔2 d更換該培養(yǎng)基。3次篩選后加普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收集細胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞凋亡檢測

對細胞凋亡分析，使用細胞凋亡檢測試劑盒（Becton Dickinson公司，美國）進行膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI雙染色。以不同濃度的Poly I：C處理24 h處理后，收集THP-1細胞，PBS漂洗一遍后，300 μL結合緩沖液重懸細胞，加入FITC標記膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）各5 μL，避光孵育15 min，隨后在細胞懸液中再加入200 μL結合緩沖液，過200目尼龍網后通過BDAccuriTMC6流式細胞分析。利用單染Annexin V和PI的細胞設門后，統(tǒng)計凋亡細胞和存活細胞比例。

1.5 熒光定量PCR

收集各組細胞，用Trizol提取細胞總RNA，使用MMLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA。以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進行PCR，各樣本重復3次。TIPE2：上游引物序列5- GGA ACA TCC AAG GCA AGA CTG-3-，下游引物序列5- AGC ACC TCA CTG CTT GTC TCA TC-3；GAPDH作為內參對照序列上游引物5-GT CGT ATT GGG CGC CTG GTC ACC-3，下游引物5-CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG GGC-3。20 μL反應體系中包括2×SYBR？誖Premix Ex TaqTM II 10 μL，上游引物（10 μM）0.5 μL，下游引物（10 μM）0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，反應條件95℃預變性3 min，以下步驟進行30個循環(huán)：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。每份標本設3個復孔，取其循環(huán)閾值（Ct）均值，分別計算各組的ΔCt（Ct目的基因-Ct內參基因），再以正常組為1進行均一化，以2-ΔΔCt表示基因的相對表達水平。

1.6 免疫印跡

THP-1細胞經Poly I：C處理24 h后，冷PBS漂洗一遍，RIPA裂解細胞，收集蛋白并用BCA法測定蛋白濃度。按20 μg/泳道蛋白量進行SDS-PAGE電泳，轉膜并用脫脂牛奶封閉后，加入抗TIPE2抗體（1∶2000）和β-actin（1∶4000）抗體于4℃孵育過夜。取出膜用TBS-T漂洗3次后，將膜和相應2抗（1∶5000）在搖床上室溫孵育1 h，取出膜后TBS-T漂洗3次后，加入ECL化學發(fā)光試劑顯色后，用LI-COR免疫印跡成像系統(tǒng)進行掃描，GAPDH條帶為內參。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism軟件進行差異顯著性分析。實驗結果數(shù)據(jù)為3次獨立實驗均值，計量結果用均值±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布，則兩組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用ANOVA方差分析；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù) Mann-Whitney 檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同TLR激活劑對TIPE2表達的影響

從封三圖1A中來看，TIPE2受到Poly I：C活化的影響，其他特異性激動劑也有一定的變化，但是Poly I：C對TIPE2的上調作用（相對表達強度在0.1 μg/mL和1 μg/mL時候分別為（0.80±0.06）和（2.30±0.21）最為顯著，Poly I：C主要為TLR3的激動劑。既往有研究顯示，Poly I：C可抑制多種細胞的增殖，并可誘導凋亡[3]，利用MTT實驗檢測不同濃度Poly I：C對THP-1細胞抑制率的影響，結果如封三圖1B和1C所示，Poly I：C可對THP-1細胞有顯著的抑制，在1 μg/mL時候其抑制率可到達42%，同時隨著作用時間的延長抑制率逐漸上調。隨后，用Annexin V/PI雙染檢測Poly I：C作用后對THP-1細胞凋亡的影響，結果發(fā)現(xiàn)，隨Poly I：C濃度增加凋亡細胞逐漸增加而存活細胞顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見封三圖1D。

2.2 TIPE2 穩(wěn)定沉默細胞株建立

既往研究顯示，TIPE2可能參與Caspase-8的活化，因此為了證實TLR3特異性抑制Poly I：C對THP-1的抑制和誘導凋亡可能與TIPE2的上調有關，通過慢病毒技術穩(wěn)定沉默THP-1細胞中TIPE2的表達，如封三圖2A所示，將構建好的載體轉化感受態(tài)細胞DH5a后，小抽得到質粒，并驚醒酶切鑒定，原質粒在酶切后的片段大小應為7872、2155和190 bp，而接入shRNA后熒光為7872、190、303和42，對于酶切正確的質粒送去測序進行驗證（封三圖2B），取正確的質粒大抽以后去內毒素用于轉染包裝病毒用。如封三圖2C所示，得到的病毒滴度較高，可以較好的感染THP-1細胞，隨后對TIPE2用免疫印跡進行驗證后如封三圖2D所示，設計的3個shRNA都可以比較好的沉默TIPE2的表達。

2.3 TIPE2沉默后對Poly I：C誘導凋亡的影響

如封三圖3所示，用Poly I：C處理穩(wěn)定沉默TIPE2的THP-1細胞后發(fā)現(xiàn)，shScramble組中的TIPE2對Poly I：C依然有很好的響應，可以顯著上調TIPE2的表達，而在shTIPE2組，Poly I：C對TIPE2的mRNA上調作用被顯著削弱。隨后比較shScramble組和shTIPE2組在Poly I：C處理后對細胞抑制率的影響，結果顯示shScramble組的細胞抑制率為（41.2±4.3）%，而在shTIPE2組為（16.0±2.3）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨后利用流式細胞檢測凋亡情況發(fā)現(xiàn)，在Poly I：C處理24 h后，shTIPE2組中凋亡細胞比例為（15.2±1.6）%，而在shScramble組中為（32.2±3.9）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示TIPE2穩(wěn)定沉默后可顯著削弱由Poly I：C誘導的THP-1的凋亡。隨后，分析Caspase-8的表達情況發(fā)現(xiàn)，在shTIPE2組中，活化形式p41/42表達下調。

3 討論

TLR是一類介導天然免疫的跨膜信號傳遞受體家族，在細胞活化信號的轉導中發(fā)揮重要作用，是聯(lián)系天然免疫與適應性免疫的橋梁。近年來，研究表明TLR介導的天然免疫在病毒誘導的炎性細胞損傷過程中同樣具有重要意義。TLR3是TLR家族中的重要成員，由胞外富含亮氨酸的重復序列、膜結構域和胞質內激酶結構域組成[4]。能夠特異性的識別致病性病毒的雙鏈dsRNA。雙鏈RNA （double stranded RNA，dsRNA）是TLR3所識別的病原相關分子模式（PAMP），多種病毒在復制期間可以產生大量的dsRNA，因此，TLR3可以作為機體抗病毒的重要防線。TLR3不僅在宿主抗病毒過程中具有重要作用，而且還與一些自身免疫病的發(fā)生存在密切關系。近期研究發(fā)現(xiàn)，壞死細胞釋放的RNA或體外轉錄產生的mRNA同樣可以活化TLR3，提示體內壞死組織釋放的RNA可以作為TLR3的內源性配體啟動或調節(jié)免疫應答。由于大部分自身免疫病并未發(fā)現(xiàn)與病毒感染具有直接聯(lián)系，因此，內源性配體對TLR3的活化在自身免疫病的發(fā)病機制中可能具有重要意義。

腫瘤壞死因子-α誘導蛋白-8樣分子2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2，TIPE2）作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，與腫瘤壞死因子誘導蛋白-8家族成員擁有某些共有序列，TIPE2選擇性表達的在淋巴源性和髓源性免疫細胞中，對固有免疫和細胞免疫起到負性調控作用?？梢种萍せ钷D錄因子ap-1和nf-kb的活化[2，5]。與小鼠主要在淋巴細胞中表達所不同的是，tipe2在人體的多數(shù)組織中都有表達，比如干細胞、神經元腦組織和腦干中、食管以及宮頸的鱗狀上皮細胞中、膀胱和尿道的交界處、結腸、胃腺上皮細胞、結腸、闌尾中都有表達[6]。尤其在終末分化的細胞中為高表達，前體細胞表達下調，提示一方面與增殖有關，一方面與分化以及相關蛋白的形成有關。tipe2在多個疾病中都呈現(xiàn)異常表達，包括肝炎[7]、肝癌、中風[8]、腎排異反應[9]、HCV、哮喘[10]、重癥肌無力[11]、紅斑狼瘡[12]等?；颊叩耐庵苎衪ipe2的表達在多種自身免疫性疾病中都是下調的，提示免疫細胞處于高度活化狀態(tài)。通過特異性誘導免疫細胞中TIPE2的表達，或許有助于減少抑制自身免疫細胞活性，減少對正常組織的損傷。

有研究顯示內源性TLR3的激活劑，Poly I：C可以誘導多種細胞的凋亡，如膽管上皮細胞，進而可能在肝硬化炎性損傷中發(fā)揮作用[13]。外源性的或者內源性的dsRNA可以通過TLR3或IRF-3途徑誘導多種細胞死亡，如胰腺β細胞死亡[14]、前列腺癌[15]、唾液腺上皮細胞[16]。TLR3是模式識別受體，所引起的凋亡主要與Caspase-8有關[17]。TIPE2作為Caspase-8 重要的伴侶蛋白，在其活性的發(fā)揮中扮演重要作用，因此可以認為Poly I：C刺激TLR3 活化后所引起的細胞凋亡中，其中一個途徑為通過活化Caspase-8和TIPE2 實現(xiàn)。此外，在腫瘤中的研究顯示[18]，TIPE2在多種腫瘤中表達下調，且tipe2是ras的主要抑制因子，通過抑制Ralgds后抑制ras復合物的形成，最后引起ral和akt的抑制，如果上調以后則可引起ras活性下降，細胞增殖下降，遷移減少。因此，我們推斷Poly I∶C刺激活化tlr3 以后通過上調tipe2的表達，可能還可進一步引起ras的抑制，從而抑制細胞增殖，并可能影響細胞的遷移，吞噬和抗菌的能力。tipe2缺失后肝癌細胞增殖和遷移速度加快，并可以抑制細胞胞吐，而過量表達tipe2以后則可以抑制體內外肝癌細胞則增殖遷移和侵襲[19， 20]，后續(xù)研究顯示和rac1和減少F-actin以及MMP-9，以及uPA的活化有關，我們在研究中也觀察到沉默tipe2后，thp-1細胞增殖加快，與既往研究相吻合[19，20]。

因此，TIPE2不僅在自身免疫系統(tǒng)疾病中扮演重要作用，同時在腫瘤的發(fā)展中也具有一定的意義，人為上調TIPE2在腫瘤細胞中的表達可能有助于抑制癌細胞增殖和遷移，但是也有可能影響免疫細胞的活化，因此，如果將TIPE2作為藥物靶點開發(fā)腫瘤治療藥物時，應該注意到對正常免疫系統(tǒng)的負面影響。

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（收稿日期：2016-02-19）