江潔曙　王珊珊　方晶晶

[摘要] 目的 觀察TIPE2穩(wěn)定沉默后對TLR激動劑Poly I：C誘導(dǎo)THP-1凋亡的影響。 方法 以THP-1細(xì)胞為研究對象，使用不同TLR激活劑與THP-1細(xì)胞孵育后，采用熒光定量PCR檢測TIPE2 mRNA表達(dá)。應(yīng)用慢病毒技術(shù)穩(wěn)定沉默TIPE2表達(dá)后，MTT法檢測細(xì)胞增殖，Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，免疫印跡分析TIPE2沉默后Caspase-8表達(dá)水平變化。 結(jié)果 TLRs激活劑中TLR3特異性激活劑Poly I：C可以顯著上調(diào)TIPE2的表達(dá)（P<0.05），隨作用時間延長，可顯著抑制THP-1細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。利用慢病毒技術(shù)穩(wěn)定沉默THP-1細(xì)胞中TIPE2表達(dá)以后，可顯著削弱Poly I：C誘導(dǎo)的TIPE2表達(dá)（P<0.05），TIPE2沉默后，Poly I：C抑制THP-1增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)顯著削弱，隨后免疫印跡的結(jié)果顯示，Caspase-8的活化形式，p41/42表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論 Poly I：C通過上調(diào)TIPE2表達(dá)可抑制THP-1細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定沉默TIPE2后可一定程度削弱上述效應(yīng)，可能與下調(diào)Caspase-8的活性形式表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Poly I：C；TIPE2；免疫；TLR；凋亡

[中圖分類號] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）16-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of stably silent TIPE2 on THP-1 apoptosis induced by TLR agonist Poly I：C. Methods THP-1 cells were selected as the study subjects. The expression of TIPE2 mRNA was detected by fluorogenic quantitative PCR after incubation of THP-1 cells with different TLR activating agents. After stable silence of TIPE2 by lentiviral technique， the cell proliferation was detected by MTT， apoptosis was detected by Annexin V/PI double-staining method， and changes of Caspase-8 expression level after silence of TIPE2 was analyzed by western blot. Results TLR3 specific activator Poly I：C could significantly up-regulate the expression of TIPE2（P<0.05）. Along with the time of action， it could significantly inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis. Stable silence of TIPE2 in THP-1 by lentiviral technique could significantly impair the TIPE2 expression induced by Poly I：C （P<0.05）. After silence of TIPE2， the effects of Poly I：C on inhibition the proliferation of THP-1 and induction of apoptosis were significantly impaired， and the result of following western blot showed active form of Caspase-8 and down-regulation of p41/42 expression. Conclusion By up-regulating the expression of TIPE2， Poly I：C can inhibit the proliferation of THP-1， and induce apoptosis， which can be partially impaired by stable silence of TIPE2， possibly due to down-regulation of Caspase-8 active form expression.

[Key words] Poly I：C； TIPE2； Immune； TLR； Apoptosis

免疫系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維護機制極其復(fù)雜和神秘，改變調(diào)控免疫細(xì)胞死亡或者活化擴增免疫細(xì)胞均可以打破免疫細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境，最終帶來極為致命的炎性疾病，目前研究發(fā)現(xiàn)一組超家族蛋白對免疫系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。尤其是具有hexahelical bundle 結(jié)構(gòu)的蛋白稱之為死亡效應(yīng)domain（DED），與Caspase家族蛋白的CARD結(jié)構(gòu)域以及募集區(qū)域有結(jié)構(gòu)類似，參與到細(xì)胞死亡和其他的信號通路中。

TIPE中壞死因子誘導(dǎo)蛋白8-類似蛋白2作為這類家族蛋白的成員之一，近年來，在機體免疫的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中扮演重要作用，其主要機制與調(diào)控T細(xì)胞受體和Toll樣受體信號通路有關(guān)，除了在炎癥組織中表達(dá)外，TIPE2還在髓樣組織和多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，說明其中可能發(fā)揮著不同的功能[1]。有報道顯示，TIPE2可以調(diào)控Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）的表達(dá)，并對周圍不同的刺激信號強度產(chǎn)生響應(yīng)[2]。但是上游TLR的活化是否也可以影響TIPE2的表達(dá)，是否可以影響人單核/巨噬細(xì)胞活性和增殖？尚未見有相關(guān)的報道。本項目于2014年1月～2015年12月期間，以人單核細(xì)胞株THP-1為考察對象，考察不同TLR激動劑對TIPE2表達(dá)的影響，并探討相關(guān)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和TLR激動劑處理

人THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。新生牛血清，DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶購自美國Life technology公司；人TLR1-9激動劑購自InvivoGen公司，抗人TIPE2和Caspase-8抗體購自Abcam公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。THP-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青-鏈霉素霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于含有5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中，每隔2～3天換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。細(xì)胞計數(shù)后將試劑盒中的TLR1-9特異性激動劑用培養(yǎng)液稀釋后使用，終濃度分別為0.1 μg/mL和1 μg/mL，孵育24 h后，Trizol裂解細(xì)胞，提取RNA，按照方法1.6中的描述檢測TIPE2 mRNA表達(dá)水平。

1.2細(xì)胞抑制實驗

細(xì)胞抑制率使用四甲基偶氮噻唑藍(lán)法（methlthiazoletrazolium assay，MTT assay），將THP-1細(xì)胞以1×104/mL密度接種于6孔或12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，Poly I：C配置成10 mg/mL儲液，使用時用完全培養(yǎng)稀釋，加入到細(xì)胞中使得終濃度分別為0.1 μg/mL、1 μg/mL，設(shè)置空白對照組。于24 h后收集細(xì)胞，加入5 mg/mL的MTT溶液，37℃孵育4 h后，棄上清每孔加150 μL DMSO后在酶標(biāo)儀上570 nm處讀取吸光值（OD）。實驗重復(fù)3次。計算抑制率=（1-ODPloyI：C/OD空白對照組）×100%。穩(wěn)定沉默TIPE2后的細(xì)胞抑制率基本方法同上，實驗前1 d細(xì)胞按1×104/孔鋪96孔板，設(shè)shTIPE2穩(wěn)定沉默組（經(jīng)過嘌呤霉素篩選后穩(wěn)定沉默TIPE2的THP-1細(xì)胞），shScramble組（經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的空白載體組），加入Poly I：C后孵育24 h后加入MTT檢測細(xì)胞在570 nm處的吸光度值變化。

1.3慢病毒載體構(gòu)建以及穩(wěn)定沉默TIPE2細(xì)胞株建立

退火形成雙鏈DNA片段。與雙酶切線性化后的pLKO.1-TRC載體（含GFP編碼序列）連接。取4 μL所得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取3個單克隆菌落接種至Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中，小搖過夜。用試劑盒小量提取質(zhì)粒后，分別用EcoRI和NcoI酶切鑒定，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。鑒定正確的質(zhì)粒命名為：pLKO.1-TRC-TIPE2-shRNA1。將酶切鑒定正確的細(xì)菌送測序以進(jìn)一步確認(rèn)序列。

病毒包裝時，轉(zhuǎn)染前1 d對293T細(xì)胞進(jìn)行分皿。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含shTIPE2或shScramble質(zhì)粒，分別同pΔ8.91及pMD2.G這2個包裝質(zhì)粒按照10∶10∶1的質(zhì)量比混合后，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。12 h后更換完全培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。48～72 h期間收集上清，0.45 μm濾器過濾后備用。感染時，取對數(shù)生長期THP-1細(xì)胞，接種于6孔板培養(yǎng)12 h后，棄上清每孔滴加含病毒液體200 μL，加入含polybrene（濃度4 μg/mL）的培養(yǎng)基，感染8 h后換普通培養(yǎng)基；48 h后加含嘌呤霉素（濃度0.5 μg/mL）的培養(yǎng)基，隔2 d更換該培養(yǎng)基。3次篩選后加普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

對細(xì)胞凋亡分析，使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Becton Dickinson公司，美國）進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI雙染色。以不同濃度的Poly I：C處理24 h處理后，收集THP-1細(xì)胞，PBS漂洗一遍后，300 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）各5 μL，避光孵育15 min，隨后在細(xì)胞懸液中再加入200 μL結(jié)合緩沖液，過200目尼龍網(wǎng)后通過BDAccuriTMC6流式細(xì)胞分析。利用單染Annexin V和PI的細(xì)胞設(shè)門后，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞和存活細(xì)胞比例。

1.5 熒光定量PCR

收集各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以各組cDNA為模板，加入緩沖液、引物等進(jìn)行PCR，各樣本重復(fù)3次。TIPE2：上游引物序列5- GGA ACA TCC AAG GCA AGA CTG-3-，下游引物序列5- AGC ACC TCA CTG CTT GTC TCA TC-3；GAPDH作為內(nèi)參對照序列上游引物5-GT CGT ATT GGG CGC CTG GTC ACC-3，下游引物5-CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG GGC-3。20 μL反應(yīng)體系中包括2×SYBR？誖Premix Ex TaqTM II 10 μL，上游引物（10 μM）0.5 μL，下游引物（10 μM）0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性3 min，以下步驟進(jìn)行30個循環(huán)：95℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。每份標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔，取其循環(huán)閾值（Ct）均值，分別計算各組的ΔCt（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），再以正常組為1進(jìn)行均一化，以2-ΔΔCt表示基因的相對表達(dá)水平。

1.6 免疫印跡

THP-1細(xì)胞經(jīng)Poly I：C處理24 h后，冷PBS漂洗一遍，RIPA裂解細(xì)胞，收集蛋白并用BCA法測定蛋白濃度。按20 μg/泳道蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜并用脫脂牛奶封閉后，加入抗TIPE2抗體（1∶2000）和β-actin（1∶4000）抗體于4℃孵育過夜。取出膜用TBS-T漂洗3次后，將膜和相應(yīng)2抗（1∶5000）在搖床上室溫孵育1 h，取出膜后TBS-T漂洗3次后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后，用LI-COR免疫印跡成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，GAPDH條帶為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行差異顯著性分析。實驗結(jié)果數(shù)據(jù)為3次獨立實驗均值，計量結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布，則兩組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用ANOVA方差分析；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù) Mann-Whitney 檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同TLR激活劑對TIPE2表達(dá)的影響

從封三圖1A中來看，TIPE2受到Poly I：C活化的影響，其他特異性激動劑也有一定的變化，但是Poly I：C對TIPE2的上調(diào)作用（相對表達(dá)強度在0.1 μg/mL和1 μg/mL時候分別為（0.80±0.06）和（2.30±0.21）最為顯著，Poly I：C主要為TLR3的激動劑。既往有研究顯示，Poly I：C可抑制多種細(xì)胞的增殖，并可誘導(dǎo)凋亡[3]，利用MTT實驗檢測不同濃度Poly I：C對THP-1細(xì)胞抑制率的影響，結(jié)果如封三圖1B和1C所示，Poly I：C可對THP-1細(xì)胞有顯著的抑制，在1 μg/mL時候其抑制率可到達(dá)42%，同時隨著作用時間的延長抑制率逐漸上調(diào)。隨后，用Annexin V/PI雙染檢測Poly I：C作用后對THP-1細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨Poly I：C濃度增加凋亡細(xì)胞逐漸增加而存活細(xì)胞顯著減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖1D。

2.2 TIPE2 穩(wěn)定沉默細(xì)胞株建立

既往研究顯示，TIPE2可能參與Caspase-8的活化，因此為了證實TLR3特異性抑制Poly I：C對THP-1的抑制和誘導(dǎo)凋亡可能與TIPE2的上調(diào)有關(guān)，通過慢病毒技術(shù)穩(wěn)定沉默THP-1細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)，如封三圖2A所示，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a后，小抽得到質(zhì)粒，并驚醒酶切鑒定，原質(zhì)粒在酶切后的片段大小應(yīng)為7872、2155和190 bp，而接入shRNA后熒光為7872、190、303和42，對于酶切正確的質(zhì)粒送去測序進(jìn)行驗證（封三圖2B），取正確的質(zhì)粒大抽以后去內(nèi)毒素用于轉(zhuǎn)染包裝病毒用。如封三圖2C所示，得到的病毒滴度較高，可以較好的感染THP-1細(xì)胞，隨后對TIPE2用免疫印跡進(jìn)行驗證后如封三圖2D所示，設(shè)計的3個shRNA都可以比較好的沉默TIPE2的表達(dá)。

2.3 TIPE2沉默后對Poly I：C誘導(dǎo)凋亡的影響

如封三圖3所示，用Poly I：C處理穩(wěn)定沉默TIPE2的THP-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，shScramble組中的TIPE2對Poly I：C依然有很好的響應(yīng)，可以顯著上調(diào)TIPE2的表達(dá)，而在shTIPE2組，Poly I：C對TIPE2的mRNA上調(diào)作用被顯著削弱。隨后比較shScramble組和shTIPE2組在Poly I：C處理后對細(xì)胞抑制率的影響，結(jié)果顯示shScramble組的細(xì)胞抑制率為（41.2±4.3）%，而在shTIPE2組為（16.0±2.3）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨后利用流式細(xì)胞檢測凋亡情況發(fā)現(xiàn)，在Poly I：C處理24 h后，shTIPE2組中凋亡細(xì)胞比例為（15.2±1.6）%，而在shScramble組中為（32.2±3.9）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示TIPE2穩(wěn)定沉默后可顯著削弱由Poly I：C誘導(dǎo)的THP-1的凋亡。隨后，分析Caspase-8的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在shTIPE2組中，活化形式p41/42表達(dá)下調(diào)。

3 討論

TLR是一類介導(dǎo)天然免疫的跨膜信號傳遞受體家族，在細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁。近年來，研究表明TLR介導(dǎo)的天然免疫在病毒誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞損傷過程中同樣具有重要意義。TLR3是TLR家族中的重要成員，由胞外富含亮氨酸的重復(fù)序列、膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成[4]。能夠特異性的識別致病性病毒的雙鏈dsRNA。雙鏈RNA （double stranded RNA，dsRNA）是TLR3所識別的病原相關(guān)分子模式（PAMP），多種病毒在復(fù)制期間可以產(chǎn)生大量的dsRNA，因此，TLR3可以作為機體抗病毒的重要防線。TLR3不僅在宿主抗病毒過程中具有重要作用，而且還與一些自身免疫病的發(fā)生存在密切關(guān)系。近期研究發(fā)現(xiàn)，壞死細(xì)胞釋放的RNA或體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA同樣可以活化TLR3，提示體內(nèi)壞死組織釋放的RNA可以作為TLR3的內(nèi)源性配體啟動或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。由于大部分自身免疫病并未發(fā)現(xiàn)與病毒感染具有直接聯(lián)系，因此，內(nèi)源性配體對TLR3的活化在自身免疫病的發(fā)病機制中可能具有重要意義。

腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白-8樣分子2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2，TIPE2）作為一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，與腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白-8家族成員擁有某些共有序列，TIPE2選擇性表達(dá)的在淋巴源性和髓源性免疫細(xì)胞中，對固有免疫和細(xì)胞免疫起到負(fù)性調(diào)控作用?？梢种萍せ钷D(zhuǎn)錄因子ap-1和nf-kb的活化[2，5]。與小鼠主要在淋巴細(xì)胞中表達(dá)所不同的是，tipe2在人體的多數(shù)組織中都有表達(dá)，比如干細(xì)胞、神經(jīng)元腦組織和腦干中、食管以及宮頸的鱗狀上皮細(xì)胞中、膀胱和尿道的交界處、結(jié)腸、胃腺上皮細(xì)胞、結(jié)腸、闌尾中都有表達(dá)[6]。尤其在終末分化的細(xì)胞中為高表達(dá)，前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，提示一方面與增殖有關(guān)，一方面與分化以及相關(guān)蛋白的形成有關(guān)。tipe2在多個疾病中都呈現(xiàn)異常表達(dá)，包括肝炎[7]、肝癌、中風(fēng)[8]、腎排異反應(yīng)[9]、HCV、哮喘[10]、重癥肌無力[11]、紅斑狼瘡[12]等?；颊叩耐庵苎衪ipe2的表達(dá)在多種自身免疫性疾病中都是下調(diào)的，提示免疫細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)。通過特異性誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)，或許有助于減少抑制自身免疫細(xì)胞活性，減少對正常組織的損傷。

有研究顯示內(nèi)源性TLR3的激活劑，Poly I：C可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡，如膽管上皮細(xì)胞，進(jìn)而可能在肝硬化炎性損傷中發(fā)揮作用[13]。外源性的或者內(nèi)源性的dsRNA可以通過TLR3或IRF-3途徑誘導(dǎo)多種細(xì)胞死亡，如胰腺β細(xì)胞死亡[14]、前列腺癌[15]、唾液腺上皮細(xì)胞[16]。TLR3是模式識別受體，所引起的凋亡主要與Caspase-8有關(guān)[17]。TIPE2作為Caspase-8 重要的伴侶蛋白，在其活性的發(fā)揮中扮演重要作用，因此可以認(rèn)為Poly I：C刺激TLR3 活化后所引起的細(xì)胞凋亡中，其中一個途徑為通過活化Caspase-8和TIPE2 實現(xiàn)。此外，在腫瘤中的研究顯示[18]，TIPE2在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且tipe2是ras的主要抑制因子，通過抑制Ralgds后抑制ras復(fù)合物的形成，最后引起ral和akt的抑制，如果上調(diào)以后則可引起ras活性下降，細(xì)胞增殖下降，遷移減少。因此，我們推斷Poly I∶C刺激活化tlr3 以后通過上調(diào)tipe2的表達(dá)，可能還可進(jìn)一步引起ras的抑制，從而抑制細(xì)胞增殖，并可能影響細(xì)胞的遷移，吞噬和抗菌的能力。tipe2缺失后肝癌細(xì)胞增殖和遷移速度加快，并可以抑制細(xì)胞胞吐，而過量表達(dá)tipe2以后則可以抑制體內(nèi)外肝癌細(xì)胞則增殖遷移和侵襲[19， 20]，后續(xù)研究顯示和rac1和減少F-actin以及MMP-9，以及uPA的活化有關(guān)，我們在研究中也觀察到沉默tipe2后，thp-1細(xì)胞增殖加快，與既往研究相吻合[19，20]。

因此，TIPE2不僅在自身免疫系統(tǒng)疾病中扮演重要作用，同時在腫瘤的發(fā)展中也具有一定的意義，人為上調(diào)TIPE2在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)可能有助于抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，但是也有可能影響免疫細(xì)胞的活化，因此，如果將TIPE2作為藥物靶點開發(fā)腫瘤治療藥物時，應(yīng)該注意到對正常免疫系統(tǒng)的負(fù)面影響。

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（收稿日期：2016-02-19）