宋佳　王玨　劉蕾　王輝

摘要：以擬南芥中控制硫苷生物合成相關(guān)基因家族GS-Elong的全長CDS及蛋白序列為參考序列，在甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTN和BLASTP檢索，得到具備Score≥100、E-value≤10^-10。和Coverage I>70%條件的甘藍(lán)注釋基因作為擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因的候選同源基因，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行同源性和基因結(jié)構(gòu)比較及聚類分析。結(jié)果顯示，在甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)4個(gè)旁系同源基因（Bo1020647、Bo1017070、B01037823和B01017071）。甘藍(lán)和擬南芥GS-Elong位點(diǎn)同源基因在核酸水平上的一致性為66.1%～84.3%；甘藍(lán)4個(gè)旁系同源基因問的一致性在62.0%～83.7%之間。甘藍(lán)和擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因在外顯子數(shù)目、大小方面高度一致，但B01017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因少3個(gè)和1個(gè)外顯子。系統(tǒng)進(jìn)化及共線性分析初步確定，甘藍(lán)中存在2個(gè)BoMAM1（B01017070和B01020647）和2個(gè)BoMAM3（B01017071和B01037823）。

關(guān)鍵詞：十字花科植物；甘藍(lán)；硫代葡萄糖苷；GS-Elong

中圖分類號(hào)：S635：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942（2016）03—0005—04

甘藍(lán)（BrCLssica oleracea L.）為十字花科蕓薹屬植物，源于地中海至北海沿岸，是世界上廣泛種植培育的一種蔬菜，具有較高的經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值。隨著生活水平的提高，人們對(duì)蔬菜作物的營養(yǎng)品質(zhì)及保健作用要求也逐漸提高。甘藍(lán)類蔬菜作物是人們公認(rèn)的抗癌蔬菜之一，其抗癌活性主要來源于包括異硫氰酸鹽在內(nèi)的硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷（Glucosinolate）簡稱硫苷，又叫芥子油苷（Mustard oil glucoside），是植物中一種富含硫和氮的次生代謝產(chǎn)物。目前已明確結(jié)構(gòu)的硫苷至少有120種，其中大多數(shù)分布于十字花科植物中，它們作為風(fēng)味物質(zhì)存在于十字花科蔬菜和調(diào)味類作物中而被人類社會(huì)認(rèn)識(shí)已久。在近幾十年中人們漸漸發(fā)現(xiàn)，這種含氮和硫的植物次生代謝物質(zhì)具有抗癌、生物殺菌和保護(hù)植物作用，其重要性越來越受到人們的重視和關(guān)注。例如，保健蔬菜西蘭花中的抗癌活性物質(zhì)蘿卜硫素（Sulforaphane）就是4-甲基亞磺酰丁基硫苷（Glucoraphanin，GRA）的降解產(chǎn)物。

通過對(duì)擬南芥中控制脂肪族硫苷側(cè)鏈長度的GS-Elong QTL位點(diǎn)的克隆，人們發(fā)現(xiàn)了三個(gè)基因MAM1、MAM2和MAM3。研究發(fā)現(xiàn)，MAM1在側(cè)鏈延伸的前3個(gè)循環(huán)中具有催化作用，MAM2僅對(duì)第1個(gè)循環(huán)起作用，而MAM3負(fù)責(zé)前6個(gè)循環(huán)?；蚯贸@示，MAM2只對(duì)參與1次側(cè)鏈延伸的脂肪族硫苷生成具有重要作用，MAMl主要控制參與2次側(cè)鏈延伸循環(huán)的脂肪族硫苷的合成，MAM3則可以生成所有長度的脂肪族硫苷，但特別容易生成發(fā)生1次、5次和6次循環(huán)的硫苷。在所有的擬南芥基因型中，僅有1個(gè)（Sorbo）同時(shí)存在MAMl和MAM2，其它的只含有MAMl和MAM2中的1個(gè)。MAM位點(diǎn)的多態(tài)性導(dǎo)致了硫苷結(jié)構(gòu)的多樣性，這可能是為了更好地適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的挑戰(zhàn)。

CS-Elong位點(diǎn)負(fù)責(zé)擬南芥和蕓薹屬植物中占主導(dǎo)地位的3或4碳脂肪族硫苷的產(chǎn)生，在Streptanthus中，GS-Elong位點(diǎn)也負(fù)責(zé)5碳硫苷的生成，在其它物種中甚至負(fù)責(zé)更長碳鏈硫苷的合成，這可能是由位點(diǎn)的進(jìn)化引起的。GS-Elong位點(diǎn)基因編碼MAM酶家族，該酶家族既直接影響硫苷側(cè)鏈長度，也通過控制GS-PRO位點(diǎn)進(jìn)一步影響硫苷側(cè)鏈不同基團(tuán)的形成。

CS-Elong的功能在擬南芥中研究得比較透徹，但在甘藍(lán)中的研究很少。本研究主要以生物信息學(xué)分析為主要技術(shù)手段，充分詳細(xì)地挖掘甘藍(lán)EST數(shù)據(jù)庫，并對(duì)甘藍(lán)GS-Elong候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析和討論，為甘藍(lán)GS-Elong基因的克隆以及硫苷甘藍(lán)新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因（At5g23010、At5g23020和AJ486899）均來源于TAIR（www.ar-abidopsis.org）和NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）；甘藍(lán)基因組及基因注釋數(shù)據(jù)庫來源于NCBI（http：∥Brassicadb.org）；白菜GS-Elong基因來源于BRAD（http：∥Brassieadb.org），并且參考Wang等的研究；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建所涉及蛋白序列均來源于UniProt（WWW.uniprot.org）、TAIR（www.arabidopsis.org）和BRAD（http：∥Brassi-cadb.org）。

1.2試驗(yàn)方法

利用擬南芥GS-Elong基因的全長CDS及蛋白序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）中對(duì)甘藍(lán)基因組及注釋基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN及BLASTP檢索，得到具備Score≥100、E-value≤10¹⁰。和Coverage≥70%條件的甘藍(lán)注釋基因作為擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因的候選同源基因。多序列比對(duì)及聚類分析采用Mega軟件。序列一致性分析和點(diǎn)陣圖分別采用EMBOSS軟件包的Needle程序和Polydot程序（emboss.source-forge.net）。

2結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)基因的預(yù)測(cè)

針對(duì)擬南芥GS-Elong位點(diǎn)中3個(gè)硫苷生物合成基因（MAM1、MAM2和MAM3），采用BLASTN和BLASTP程序?qū)Ω仕{(lán)基因組和44 940個(gè)注釋基因（http：∥brassicadb.org/brad/）進(jìn)行檢索分析，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)同源基因（B01020647、B01017070、B01037823和Bol017071）。

GS-Elong位點(diǎn)基因是脂肪族硫苷側(cè)鏈延伸的直接作用基因，擬南芥中該位點(diǎn)存在的3個(gè)旁系同源基因MAM1、MAM2和MAM3均位于第5號(hào)染色體，并且MAM1（At5g23010）與MAM3（At5g23020）為tandem基因。甘藍(lán)中該位點(diǎn)預(yù)測(cè)的4個(gè)基因中的2個(gè)tandem基因B01017070和B01017071位于第6號(hào)染色體，另外2個(gè)基因B01020647和B01037823分別位于第3號(hào)和第4號(hào)染色體。

2.2甘藍(lán)與擬南芥GS—Elong位點(diǎn)基因的同源比較

經(jīng)在核酸水平上的一致性比較發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)和擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因高度同源（表1），擬南芥3個(gè)旁系同源基因問的一致性在82.7%～97.2%之間，其中MAM1和MAM2間的一致性高達(dá)97.2%。甘藍(lán)4個(gè)旁系同源基因與擬南芥同源基因的一致性維持在66.1%～84.3%之間；其中B01017070、B01020647與擬南芥同源基因問的一致性較高，均在80%以上；B01037823與擬南芥同源基因問一致性次之，在72.5%以上；B01017071與擬南芥同源基因問的一致性最低，維持在66%左右。甘藍(lán)4個(gè)旁系同源基因問的一致性保持在62.0%～83.7%之間，其中B01017071與甘藍(lán)中其他同源基因存在62.0%～67.3%的一致性，其他3個(gè)同源基因間的一致性則維持在比較高的水平（73.8%～83.7%）。

2.3擬南芥和甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)比較

擬南芥與甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)同源基因結(jié)構(gòu)比較如圖1所示，6個(gè)基因整體結(jié)構(gòu)較為類似，尤其是外顯子數(shù)目和大小高度一致，只有B01017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因少3個(gè)和1個(gè)外顯子，內(nèi)含子的大小是導(dǎo)致各GS-Elong位點(diǎn)基因全長存在較大差異的主要原因。

擬南芥和甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)在基因外顯子數(shù)目、大小及所占基因比例等方面的比較如表2所示，擬南芥MAM1和MAM3均包含10個(gè)外顯子，并且其全基因長度、CDS長度、CDS所占全基因的比例均較為一致，僅在Exon10上MAM1較MAM3多9個(gè)堿基。甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)的4個(gè)基因在全基因長度方面差異較大，B01037823最長，為4258 bp；B01017070最短，為2795 bp。擬南芥和甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)CDS長度差別不大，B01017070最長，為1 527 bp；B01017071最短，為1236 bp。B01017070、B01017071、B01020647和B01037823分別含有10、7、10和9個(gè)外顯子。B01017070的Exonl～Exon8與擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因大小一致，僅在Exon9和Exon10中稍有差別；B01017071缺少Exon7、Exon8和Exon10，另外Exonl和Exon9較擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因分別少15和3個(gè)堿基；B01020647的Exon2～Ex-on9與擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因大小一致，而Exonl少12個(gè)堿基，Exon10稍長于擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因；B01037823在Exon2、Exon3、Ex-or6～Exon9與擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因保持一致，但缺少Exon4，另外，Exonl和Exonl0較短。擬南芥和甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)基因CDS所占全基因的比例在各基因間存在較大差別，其中擬南芥MAM1和MAM3所占比例相差較小，分別為40.00%和40.66%；而甘藍(lán)4個(gè)基因的比例范圍相差較大，為30.58%～54.63%，其中B01037823最小，B01017070最大。

2.4 GS-Elong位點(diǎn)基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)擬南芥（AT）、白菜（CC）和甘藍(lán)（B0）3個(gè)已有參考基因組物種的GS-Elong位點(diǎn)蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果（圖2）顯示，擬南芥MAM1與MAM2親緣關(guān)系較近，與MAM3親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。參考甘藍(lán)和擬南芥基因組、甘藍(lán)和白菜基因組間的共線性，初步確定甘藍(lán)中分別存在2個(gè)BoMAM1（Bo1017070和Bo1020647）和2個(gè)BoMAM3（Bo1017071和Bo1037823）。

3小結(jié)與討論

本研究借助生物信息學(xué)分析技術(shù)，在甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)預(yù)測(cè)到4個(gè)旁系同源候選基因（Bol020647、Bol017070、Bol037823和Bol017071）。甘藍(lán)和擬南芥GS-Elong位點(diǎn)同源基因間在核酸水平上的一致性為66.1%～84.3%；甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)4個(gè)旁系同源問的一致性保持在62.0%～83.7%之間。甘藍(lán)和擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因在外顯子數(shù)目、大小方面高度一致，但其中2個(gè)甘藍(lán)GS-Elong位點(diǎn)基因Bol017071和B01037823分別較擬南芥GS-Elong位點(diǎn)基因少3個(gè)和1個(gè)外顯子。系統(tǒng)進(jìn)化及共線性分析初步確定，甘藍(lán)中分別存在2個(gè)BoMAM1（Bol017070和Bol020647）和2個(gè)BoMAM3（Bol017071和Bol037823）。

擬南芥、甘藍(lán)和白菜基因組大小分別為157、520 Mb和485 Mb。有研究表明白菜和甘藍(lán)基因組存在多倍化事件，與多倍化事件理論上伴隨的同源基因多拷貝現(xiàn)象相呼應(yīng)，在擬南芥中存在3個(gè)MAM旁系同源基因（其中MAM2僅在擬南芥1個(gè)生態(tài)型中出現(xiàn)），在白菜中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)旁系同源基因（http：∥Brassicadb.org），本研究在甘藍(lán)中發(fā)現(xiàn)4個(gè)旁系同源基因。本研究結(jié)果為利用生物技術(shù)手段人為操縱甘藍(lán)中有益硫苷的結(jié)構(gòu)和數(shù)量、創(chuàng)制甘藍(lán)新品種及今后甘藍(lán)基因組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。