劉力豪 蔡琨 王曉敏

【摘要】目的：研究純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在體外對人乳腺癌細胞MCF-7的生長影響。方法：用不同劑量組對體外培養(yǎng)的MCF-7細胞分別干預12、24、36、48、72h后，用MTT法觀察其對MCF-7細胞的生長影響。結(jié)果：①純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現(xiàn)出對MCF-7細胞穩(wěn)定的抑制作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；②純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用，在一定濃度、作用時間有依賴關(guān)系，與大豆異黃酮抑制作用相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：純種發(fā)酵淡豆豉有明確的抗乳腺癌的作用，其24h IC50為（7.58±1.57）mg/L。

【關(guān)鍵詞】純種發(fā)酵；淡豆豉；異黃酮；MTT；MCF-7細胞；乳腺癌

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2016）07-0023-05

Abstract：Objective To observe the inhibiting effect on isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum （SSP） to MCF-7 cells′ reproductive activity in vitro.Methods MCF-7 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of isoflavones extracts from pure fermented SSP for 12，24，36，72 hours respectively. The inhibition of pure fermented SSP to MCF-7 cells were detected by MTT Method.Results （1）The isoflavones extracts from pure fermented SSP show the inhibition to MCF-7 cells compared with the negative control group，by different concentrations of 5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L for 12h，24h and 36 h （P<0.05），except 24h 10mg/L. （2） Pure fermented SSP could markedly inhibit proliferation of MCF-7 cell line in a time-dependent and dose-dependent manner. The effects of Pure fermented SSP were no difference compared with those of soy isoflavones（P>0.05）.Conclusion The results proved the inhibition of isoflavones extracts from pure fermented SSP show the best inhibiting effect on the proliferation of MCF-7 cells， 24h IC50（7.58±1.57）mg/L.

Keywords：pure fermented， Semen SojaePraeparatum， isoflavones， MTT， breast cancer

淡豆豉是一味以大豆為原材料經(jīng)發(fā)酵而成的傳統(tǒng)中藥，始載于《名醫(yī)別錄》，有解表除煩、宣發(fā)郁熱之功效，適用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥[1]，現(xiàn)已廣泛應用于成藥之中，如維C銀翹片、銀翹解毒片等。傳統(tǒng)制作淡豆豉的方法見于藥典，使用桑葉、青蒿的煎煮液浸泡大豆晾干后，再用桑葉、青蒿覆蓋初步發(fā)酵，再放入容器發(fā)酵近20d后得淡豆豉，其制法繁瑣、耗時，缺乏劑量標準，量產(chǎn)需要制作經(jīng)驗，且發(fā)酵中易受其他微生物的干擾導致失敗、甚至產(chǎn)生毒素，這些都直接影響淡豆豉的品控、量產(chǎn)。本實驗前期分離得到高效淡豆豉發(fā)酵菌株，量化并優(yōu)化發(fā)酵工序，僅需7d即能高效、安全、穩(wěn)定獲得大量純種發(fā)酵淡豆豉[2-3]。乳腺癌作為女性三大惡性腫瘤之一，嚴重危害婦女健康。大量流行病學研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群經(jīng)常食用富含植物雌激素的食物，其乳腺癌發(fā)病率較歐美人群明顯降低，而大豆及其相關(guān)制品如豆豉、納豆等則是植物雌激素的主要膳食來源[4-5]，植物雌激素主要包含異黃酮類如大豆苷元、染料木素、木酚類等。有眾多文獻指出[6-8]，大豆異黃酮對體外癌細胞有抗腫瘤作用。進一步研究顯示大豆異黃酮中游離形式生物活性相對非游離型要高，但僅占大豆總異黃酮的2%～3%。大豆發(fā)酵后的淡豆豉總異黃酮量與大豆相當，但游離形式苷元是大豆中的10～40倍[9]。因此，淡豆豉可能具有更加理想的防治乳腺癌作用。

目前國內(nèi)外學者對中藥淡豆豉抗腫瘤功能的研究相對不多，對于純種發(fā)酵淡豆豉對人乳腺癌細胞（MCF-7）的研究更加少見，純種發(fā)酵淡豆豉對MCF-7細胞的生長影響如何則需進一步研究。本研究選用前期分離的高效淡豆豉發(fā)酵菌株，并采用前期得出的優(yōu)化發(fā)酵條件發(fā)酵得到純種發(fā)酵淡豆豉，通過一定的提取方法獲得單位質(zhì)量活性物質(zhì)較高的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，用高效液相色譜法測定提取物主要有效成分含量，以大豆異黃酮作為陽性藥物，使用MTT法檢測其對MCF-7癌細胞的生長影響，為進一步擴展純種發(fā)酵淡豆豉的臨床應用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人乳腺癌MCF-7細胞株，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑 DMEM-H培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio公司）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（Solarbio公司）；0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶（M&C Gene Technology）；實驗所使用其他化學試劑均為分析純級，購于化學試劑公司。

1.1.3 藥物 陽性藥物大豆異黃酮購于江萊生物公司（精密級，80%），批號：JL 150208005；純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物由本課題組制備及提取。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司USA3131型）；離心機（Thermo公司X1R型）；自動酶標儀（Thermo公司1510型）；倒置顯微鏡（DSZ2000X型）；全自動高壓滅菌鍋（TOMY公司SX-700型）；高效液相色譜儀HPLC（Agilent公司1260型）；色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；水浴振蕩器；水浴鍋；分析天平；烘箱；96孔培養(yǎng)板及T25細胞培養(yǎng)瓶（Corning公司）；移液器（大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 純種發(fā)酵淡豆豉的制備 購于市場的干大豆，經(jīng)篩選、室溫清水浸泡（12h）后，使干黃豆充分吸收水分膨脹，晾干，按一定質(zhì)量分裝到大三角燒瓶內(nèi)，經(jīng)15min，115℃處理后冷卻，在超凈臺內(nèi)無菌操作，接種高效淡豆豉發(fā)酵菌液（按大豆30g∶菌液10ml比例）充分混勻后，于25℃溫箱培養(yǎng)發(fā)酵7d，獲得純種發(fā)酵淡豆豉。

1.2.2 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的制備 將純種發(fā)酵淡豆豉于60℃干燥回收，粉碎，過40目篩，稱取粉末200g，用石油醚脫脂，減壓干燥得到粉末，取100g加入pH=5緩沖液1000ml（由0.2mol/L檸檬酸鈉與0.1mol/L檸檬酸配制成），加入10mg β-葡萄糖苷酶、1000ml乙酸乙酯，45℃、超聲60min，減壓干燥得異黃酮粗品，按粗品、大孔樹脂1∶40比例上AB-8大孔樹脂柱乙醇反復洗脫，濃縮、干燥得純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物。

1.2.3 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物主要成分含量測定 參照文獻[10]，使用高效液相色譜（HPLC）法測定提取物異黃酮含量，色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），大豆苷元測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶55∶1；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。染料木素測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶65∶1；檢測波長：262nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。精密稱取標準品大豆苷元（daidzein，5.25mg）、染料木素（genistein，5.55mg），加80%甲醇溶解，定容至50ml，得0.105 mg/ml 大豆苷元對照品溶液、0.111 mg/ml染料木素標準品溶液。

分別精密稱取精密稱取純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物0.5g，用10ml含有2mol/L鹽酸的80%乙醇溶解大豆苷元樣品，用10ml 80%乙醇溶解染料木素樣品，均超聲15min，4000r/min 離心5min，重復兩次，分別合并提取液，水浴蒸干，用80%的乙醇定容至10ml并經(jīng)0.45μm膜過濾備用。

1.2.4 藥物組的配置 精密稱取1mg純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，充分溶解于5ml無水乙醇中，加入20ml DMEM-H（不加FBS）培養(yǎng)液稀釋上述液體，得20%乙醇混合液，經(jīng)0.22μm膜過濾，用DMEM-H（不加FBS）培養(yǎng)液稀釋得到濃度為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L共8個濃度異黃酮提取物溶液，同樣方法精密稱取1mg大豆異黃酮制備以上8個濃度，全部密封、4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 MCF-7細胞的體外培養(yǎng) 將貼壁生長的MCF-7細胞經(jīng)0.02%EDTA/0.25%胰酶（2∶1）混合液消化脫壁后按一定量接種至DMEM-H培養(yǎng)液（含10%FBS）中吹散均勻，移入新細胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，及時剔除污染、死亡的細胞，本次實驗選用第四代細胞。

1.2.6 MTT實驗 實驗設(shè)對照組、空白組、不同濃度陽性對照組、不同濃度藥物組。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，倒出培養(yǎng)液，用適量PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗培養(yǎng)瓶底壁后吸出丟棄，加入0.02%EDTA/0.25%胰酶1ml，混勻，于37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察約80%細胞變圓時加入DMEM-H（含10%FBS）培養(yǎng)液3ml，輕輕反復吹打沖洗培養(yǎng)瓶底壁，經(jīng)收集離心后用DMEM-H（含10%FBS）培養(yǎng)液調(diào)整單細胞懸液濃度為4×104個/ml。以每孔100μl接種96孔板，培養(yǎng)12h使細胞貼壁生長鋪滿底部，然后給以不同濃度藥物組各100μl，對照組加入100μl 20%乙醇（DMEM-H培養(yǎng)液稀釋，不含F(xiàn)BS），空白組則加入100μL DMEM-H培養(yǎng)液（含10%FBS），每組設(shè)3個平行孔，于37℃、5%CO2孵化箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)12、24、36、48、72h后，取出，每孔加入5mg/ml MTT（由PBS配成5mg/ml濃度） 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，于低速搖床10min，靜置20min，于酶標儀測490nm各孔吸光度OD值。

生長抑制率（IR）=（1-藥物組OD值/對照組OD值）×100%

公式中藥物組為給予不同濃度的藥物實驗組，對照組為不加藥物處理的對照組。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，顯著性檢驗用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物含量測定結(jié)果 通過HPLC法檢測得到兩種異黃酮標準品與樣品HPLC分離色譜圖（圖1～4），根據(jù)兩種標準品的線性范圍配制樣品溶液濃度，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，每樣品3針。用外標法計算并換算純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的平均含量為（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的異黃酮含量約為（8.07±0.09）%。

2.2 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對MCF-7細胞的生長影響 純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h后，其濃度5、10、20、40mg/L（除24h 10mg/L外）均表現(xiàn)出對MCF-7細胞穩(wěn)定的抑制作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨藥物濃度升高，作用時間的延長，其抑制作用逐漸增強。在作用MCF-7細胞48h后，藥物組對MCF-7細胞抑制作用出現(xiàn)反復，作用MCF-7細胞72h后抑制率反而整體上升。（圖5～6）（表1～2）。

2.3 兩種藥物對MCF-7細胞生長影響的比較 根據(jù)2.2分析結(jié)果，采用純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物4個濃度（5、10、20、40mg/L）與同濃度陽性藥物大豆異黃酮在不同時段（12、24、36h）對MCF-7細胞抑制率的研究，采用重復測量設(shè)計資料的方差分析。實驗數(shù)據(jù)滿足Mauchly球形假設(shè)（P>0.05），直接采用重復測量方差分析。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與大豆異黃酮組相比較，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異無統(tǒng)計學意義（F= 1.167，P=0.373）。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與對照組相比，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異有統(tǒng)計學意義（F=7.327，P=0.004）。即在上述濃度范圍，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物有與大豆異黃酮類似的作用，對MCF-7細胞增殖有抑制作用（圖7）。

3 討論

乳腺癌的病因目前尚未定論，病因?qū)W研究顯示可能與遺傳、免疫、環(huán)境、飲食等因素有關(guān)，比較公認且經(jīng)多年研究證實的，即為乳腺癌為一種雌激素依賴性腫瘤，內(nèi)源性雌激素水平持續(xù)升高或外源性雌激素大量補充，導致雌激素長期暴露都會增加乳腺癌發(fā)生的概率[11]。植物雌激素類物質(zhì)是一類源于植物、活性與雌激素相似的雜環(huán)多酚類天然化合物，能與人體內(nèi)的雌激素受體（ER）結(jié)合從而引發(fā)雌激素效應，但其結(jié)合率、效能遠遠低于雌激素，但又占據(jù)雌激素受體，從而消減了雌激素長期暴露作用，起到預防、治療乳腺癌的作用。

實驗結(jié)果表明，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的含量達（26.06±0.82）mg/g、（54.65±0.74）mg/g，總異黃酮含量約為（8.07±0.09）% 。與其他類似文獻[12-13]所公布的自然發(fā)酵淡豆豉提取物異黃酮含量相比，純種發(fā)酵淡豆豉提取物所獲得的異黃酮含量遠遠高于其他，說明純種發(fā)酵法與其他類方法相比，更加優(yōu)越，值得推廣。

在作用MCF-7細胞12、24、36h內(nèi)，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在5、10、20、40mg/L濃度對MCF-7細胞表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P<0.05），且其抑制作用與藥物濃度、作用時間呈正相關(guān)。淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L（表1）。與大豆異黃酮組對MCF-7細胞的抑制作用無明顯差異（P>0.05）），表明有效含量約8%的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物與有效含量約80%的大豆異黃酮具有相似的抑制作用，側(cè)面證明純種發(fā)酵淡豆豉所含異黃酮類活性成分較大豆異黃酮高。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮類物質(zhì)與MCF-7細胞接觸后，抑制效果立刻產(chǎn)生，則可能與持續(xù)占據(jù)ER導致MCF-7細胞增殖能力下降有關(guān)。上述結(jié)果說明純種發(fā)酵淡豆豉具有明顯的抗乳腺癌的作用。

實驗中藥物干預MCF-7細胞48h、72h后出現(xiàn)各藥物組抑制率不再呈類線性關(guān)系，而在72h后各組抑制率反而明顯抬升，并不能說明此時藥物對抑制率產(chǎn)生主導作用。MTT法檢細胞抑制率其本質(zhì)包括了增殖受限細胞和死亡細胞，在96孔板中培養(yǎng)48h、72h的細胞，其生長環(huán)境不再適宜、營養(yǎng)成分殆盡、代謝物積累、壞死細胞內(nèi)容物的釋放等都使細胞增殖受限，同時可誘發(fā)細胞凋亡，因此數(shù)據(jù)分析時，不采用48h、72h的數(shù)據(jù)。

綜上所述，純種發(fā)酵淡豆豉具有明確的抗乳腺癌的作用。其對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用與純種發(fā)酵淡豆豉濃度、作用時間呈正相關(guān)， 24h的IC50為（7.58±1.57）mg/L。純種發(fā)酵淡豆豉發(fā)揮抗乳腺癌作用的機制還需進一步的深入研究。

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（收稿日期：2016.02.02）