申艷紅　陳永萍　楊菲穎　魯娜

摘 要 番木瓜酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Tyrosine aminotransferase，TAT）是維生素E合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。在已有番木瓜果實(shí)成熟差異基因片段序列的基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)克隆了TAT基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為CpTAT。該基因全長(zhǎng)包含5′非編碼區(qū)98 bp，3′非編碼區(qū)232 bp，開(kāi)放性閱讀框1 266 bp，編碼421個(gè)氨基酸。序列分析表明，該基因?yàn)楣炔蒉D(zhuǎn)氨酶超家族成員，催化活性位點(diǎn)為第253位的賴(lài)氨酸，編碼蛋白與毛果楊、野草莓、桃、擬南芥和水稻的TAT蛋白同源性分別為83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。熒光定量分析表明，CpTAT基因在根中的表達(dá)量最高，在莖和果實(shí)中的表達(dá)較低，在葉中的表達(dá)量最低。與對(duì)照相比，外源乙烯處理能誘導(dǎo)番木瓜果實(shí)中CpTAT基因表達(dá)量升高，而1-MCP處理則抑制了該基因表達(dá)，在果實(shí)衰老期表達(dá)量升高，該基因可能在番木瓜果實(shí)成熟衰老中起作用。

關(guān)鍵詞 番木瓜；酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；基因克隆；RACE；維生素E

中圖分類(lèi)號(hào) S668.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Tyrosine aminotransferase（TAT）is one of the most important key enzymes in the vitamin E biosynthesis pathway. The full-length cDNA of TAT was isolated from papaya fruit using RACE-PCR and designated as CpTAT. The primers were designed according to a fruit ripening polymorphic fragment which was obtained from cDNA-AFLP analysis. The CpTAT cDNA sequence contains 5′-UTR of 98 bp， 3′-UTRA of 232 bp， and ORF of 1 266 bp. Sequencing analysis showed that the gene was a member of the aspartate aminotransferase superfamily， which encoding 421 amino acids and having an active site of Lys253. The amino acid sequence was 83.69%， 81.09%， 80.76%， 78.87%， and 54.67% identity with TAT from Populus trichocarpa， strawberry， peach， Arabidopsis， and rice. Real-time PCR analysis revealed that the order of relative expression level of the CpTAT gene in different papaya organs was root， stem， fruit， and leave. In addition， the CpTAT expression was induced by ethylene， inhibited by 1-MCP， and increased in aging period， indicating that CpTAT may be involved in the fruit senescence in papaya.

Key words Carica papaya； Tyrosine aminotransferase； Gene clone； RACE； Vitamin E

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.015

番木瓜（Carica papaya L.）是熱帶、亞熱帶地區(qū)常見(jiàn)果樹(shù)。番木瓜營(yíng)養(yǎng)成分多樣，除了含有比鮮橙更豐富的維生素C外，還含有豐富的維生素E[1-2]。維生素E是具有抗氧化活性的生育酚和生育三烯酚的總稱(chēng)，其中α-生育酚的活性最高[3]。由于酚基的存在，維生素E極易被過(guò)氧化物氧化，是一種較強(qiáng)的脂溶性抗氧化劑。醫(yī)學(xué)證明，維生素E與生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)的正常代謝密切相關(guān)，是治療冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、貧血、肝病和癌癥等的輔助藥物[4]。同時(shí)，維生素E還可改善動(dòng)物肉質(zhì)，提高動(dòng)物免疫力[5]。在植物中，維生素E參與清除光合器官中的自由基，保護(hù)脂類(lèi)雙層膜免受脂肪氧化酶的攻擊，保護(hù)光合器官和維持生物膜的完整性[6-7]。酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Tyrosine aminotransferase， TAT）是維生素E合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，提高該酶的表達(dá)可相應(yīng)地提高維生素E含量[8]。酪氨酸在TAT的催化下形成4-羥苯丙酮酸（4-HPP），4-HPP在4-羥苯丙酮酸雙加氧酶（HPPD）催化下生成尿黑酸，生成了維生素E的親水性頭部[9]。2012年，Riewe等人發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中敲除TAT基因大大降低了維生素E含量，進(jìn)而證明了TAT在擬南芥維生素E合成中的關(guān)鍵作用[10]。

目前，已經(jīng)從許多植物中分離克隆了TAT基因，如大豆[11]、擬南芥[12]、黃芩[13]、丹參[14]、紫蘇[15-16]等，而關(guān)于番木瓜酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及其功能的研究目前還沒(méi)有報(bào)道。本研究采用RACE技術(shù)克隆了番木瓜TAT基因全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)分析，旨為進(jìn)一步研究該基因功能，并利用其進(jìn)行基因工程提高維生素E含量改良果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 番木瓜供試品種‘大白8號(hào)采自福建閩侯木瓜園。將大小均勻、成熟期一致的綠熟期番木瓜果實(shí)進(jìn)行以下處理：（1）乙烯利處理，將果實(shí)浸泡在0.5 g/L乙烯利水溶液中3 min，自然晾干，裝箱密封2 h；（2）1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）處理，將果實(shí)置于1 μL/L 1-MCP氣體中18 h；（3）對(duì)照，將果實(shí)在清水中浸泡3 min，自然晾干，裝箱密封2 h。將處理后的果實(shí)分別放在25 ℃房間儲(chǔ)藏，于處理后6、12、24 h以及3、6 d取樣。將果肉切成小塊立即投入液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２杉竟嫌啄鄣母?、莖和完全伸展的葉片，投入液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與菌株 ExTaq、pMD18-T、T4 DNA 連接酶載體購(gòu)自TaKaRa 公司；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit購(gòu)自BD Biosciences Clontech公司；柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司； SYBR ExScriptTM RT-PCR購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。E.coli DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。1-MCP安喜布購(gòu)自臺(tái)灣利統(tǒng)股份有限公司，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 番木瓜CpTAT基因的克隆 采用改良熱硼酸小量法提取番木瓜果肉總RNA[17]，參照Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的番木瓜果實(shí)成熟差異基因片段序列（圖1）設(shè)計(jì)RACE特異引物[18]。用3′RACE特異引物TAT3-1、TAT3-2與3′端接頭引物TY-DOWN組成半巢式擴(kuò)增引物對(duì)，擴(kuò)增基因的3′端。用5′RACE特異引物TAT5-1、TAT5-2與5′端接頭引物TY-UP擴(kuò)增基因的5′端。采用25 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 18.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，特異引物與接頭引物各0.5 μL，模板1.0 μL，ExTaq酶0.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。經(jīng)兩輪擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將目的條帶割膠、回收，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆送到上海博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的3′端和5′端序列拼接，翻譯的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列進(jìn)行比較，確定基因的編碼區(qū)，設(shè)計(jì)開(kāi)放性閱讀框（Open Reading Frame， ORF）的上、下游引物TAT-U和TAT-D。然后以cDNA為模板，擴(kuò)增該基因的ORF序列，并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、基因片段的拼接和蛋白質(zhì)翻譯；用Protparam預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子式、氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)（http：//web.expasy.org/protparam/）；用SignalP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；用NCBI網(wǎng)站的CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/docs/cdd_search.html）進(jìn)行氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析；用MEGA 4.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 番木瓜CpTAT基因在不同器官以及不同處理果實(shí)中的表達(dá)分析 提取番木瓜的根、莖、葉、果肉的RNA，分別取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在CpTAT基因3′端非保守區(qū)設(shè)計(jì)引物qTAT-U和qTAT-D，以番木瓜Actin基因?yàn)閮?nèi)參[19]，用Bio-RAD進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix ExTaqTM 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，雙蒸水8.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)。以根為對(duì)照，分析CpTAT基因在不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)；以清水處理后6 h的果肉為對(duì)照，分析該基因在不同處理果實(shí)中的相對(duì)表達(dá)。用SPSS進(jìn)行鄧肯氏多重比較，Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜CpTAT基因cDNA全長(zhǎng)的獲得

5′RACE第二輪PCR擴(kuò)增出一條特異條帶，見(jiàn)圖2中的1泳道，將目的條帶割膠回收、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為1 125 bp的片段，與已知差異片段有一個(gè)長(zhǎng)105 bp的重疊區(qū)，可知為T(mén)AT基因的5′端。3′ RACE第二輪PCR擴(kuò)增出一條約為400 bp的條帶，見(jiàn)圖2中的2泳道，測(cè)序后獲得長(zhǎng)407 bp的序列，與差異片段序列重疊125 bp，是TAT基因的3′端。將3′RACE和5′RACE所測(cè)得的序列與已知差異片段序列拼接，獲得長(zhǎng)1 596 bp的cDNA序列，包含5′非編碼區(qū)98 bp，3′非編碼區(qū)232 bp，開(kāi)放性閱讀框1 266 bp。然后根據(jù)該序列設(shè)計(jì)ORF的上、下游引物，以cDNA為模板擴(kuò)增，最終獲得TAT基因ORF序列，見(jiàn)圖2中的3泳道。將此序列與該基因的3′-UTR和5′-UTR拼接，獲得了番木瓜TAT基因全長(zhǎng)cDNA的序列，將其命名為CpTAT，Genbank登錄號(hào)為KU253441。

2.2 CpTAT基因序列的生物信息學(xué)分析

將番木瓜CpTAT基因的cDNA序列翻譯成氨基酸序列，編碼421個(gè)氨基酸。Protparam分析可知，蛋白質(zhì)分子式為C2 104H3 318N556O600S17，等電點(diǎn)為6.86，分子量約為46.54 ku。用SignalP 3.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有信號(hào)肽序列，不是分泌蛋白。用NCBI網(wǎng)站的CDD進(jìn)行氨基酸序列結(jié)構(gòu)域分析，該基因?qū)儆诠炔蒉D(zhuǎn)氨酶超家族成員，催化活性位點(diǎn)為第253位的賴(lài)氨酸（圖3）。其理論推導(dǎo)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)為37.69，屬于穩(wěn)定蛋白。番木瓜TAT氨基酸序列與毛果楊、野草莓、桃、擬南芥、水稻的TAT氨基酸序列有很高的同源性，分別為83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%（圖3），說(shuō)明這個(gè)基因比較保守，可推測(cè)它們具有相同或相似的功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，番木瓜TAT與擬南芥、薺菜等十字花科植物TAT蛋白表現(xiàn)出最小的進(jìn)化距離，與單子葉植物水稻TAT蛋白進(jìn)化距離最遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 CpTAT基因的表達(dá)分析

采用Real-time PCR研究了CpTAT基因在番木瓜不同器官，以及不同處理果實(shí)中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，該基因在根、莖、葉和果實(shí)中均表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，在莖和果實(shí)中的表達(dá)較低，在葉中的表達(dá)量最低，達(dá)到顯著水平（圖5）。與對(duì)照相比，外源乙烯處理能誘導(dǎo)果實(shí)中CpTAT基因表達(dá)量升高，特別是在處理后24 h和6 d達(dá)到顯著水平；而1-MCP處理則抑制了該基因的表達(dá)，在處理后的3 d和6 d表達(dá)差異達(dá)到顯著水平。在果實(shí)處理后第6天，CpTAT基因在乙烯處理中表達(dá)量最高，對(duì)照中表達(dá)量較低，而1-MCP處理中表達(dá)量最低，達(dá)到顯著水平（圖6）。

3 討論與結(jié)論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遇到各種各樣的生物和非生物脅迫，如干旱、凍害、蟲(chóng)咬食和衰老等。在脅迫中，有氧自由基升高使脂質(zhì)和葉綠體氧化，破壞細(xì)胞[20]。維生素E可清除氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化原子團(tuán)以保護(hù)光合作用器和脂雙層膜。當(dāng)植物進(jìn)入衰老期，活性氧自由基和脂類(lèi)過(guò)氧化物自由基增加，同時(shí)也會(huì)伴隨著α-生育酚的增加，以保護(hù)細(xì)胞不受傷害[21]。TAT是維生素E合成關(guān)鍵酶[8]，很多脅迫也誘導(dǎo)TAT基因表達(dá)量升高。例如，冠菌素、茉莉酮酸甲酯、12-氧植物二烯酸或創(chuàng)傷均能誘導(dǎo)擬南芥的TAT基因表達(dá)量上升[8，12]。在本研究中，外源乙烯誘導(dǎo)CpTAT基因表達(dá)量升高，而1-MCP則抑制該基因的表達(dá)，特別是在果實(shí)處理后第6天，該基因在乙烯處理中表達(dá)量最高，對(duì)照中較低，而1-MCP處理中最低，達(dá)到顯著水平。番木瓜是典型的呼吸躍變型果實(shí)，外源乙烯促進(jìn)果實(shí)成熟衰老，1-MCP推遲衰老進(jìn)程[22-23]。果實(shí)處理后的第6天，乙烯利處理果實(shí)果皮全黃、果肉軟化，進(jìn)入全熟期，對(duì)照果實(shí)果皮半黃、果肉開(kāi)始軟化，為半熟期，而1-MCP處理果實(shí)果皮全綠，果肉硬，還處于綠熟期。CpTAT基因的表達(dá)量在不同成熟期果實(shí)中表達(dá)差異顯著，說(shuō)明該基因與果實(shí)成熟有一定相關(guān)性，在番木瓜果實(shí)成熟衰老中起作用。

本研究在已有番木瓜果實(shí)成熟差異基因片段序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)RACE技術(shù)成功克隆了維生素E合成關(guān)鍵酶基因CpTAT全長(zhǎng)序列，為進(jìn)一步利用該基因進(jìn)行基因工程提高維生素E含量，改良果實(shí)品質(zhì)奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Aravind G， Debjit B， Duraivel S， et al. Traditional and medicinal uses of Carica papaya[J]. Journal of Medicinal Plants Studies， 2013， 1（1）： 7-15.

[2] Krishna K， Paridhavi M， Patel J A. Review on nutritional， medicinal and pharmacological properties of papaya（Carica papaya Linn.）[J]. Natural Product Radiance， 2008， 7（4）： 364-373.

[3] Brigelius-Flohe R， Traber M G. Vitamin E： function and metabolism[J]. The FASEB Journal， 1999， 13（10）： 1 145-1 155.

[4] Traber M G， Sies H. Vitamin E in humans： demand and delivery[J]. Annual Review of Nutrition， 1996， 16 （1）： 321-347.

[5] Rocheford T R， Wong J C， Egesel C O， et al. Enhancement of vitamin E levels in corn[J]. Journal of the American College of Nutrition， 2002， 21（sup3）： 191S-198S.

[6] Yamauchi R， Matsushita S. Light-induced lipid peroxidation in isolated chloroplasts and role of α-tocopherol[J]. Agricultural and Biological Chemistry， 1979， 43（10）： 2 157-2 161.

[7] Goffman F D， B？hme T. Relationship between fatty acid profile and vitamin E content in maize hybrids（Zea mays L.）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2001， 49（10）： 4 990-4 994.

[8] Sandorf I， Hollander-Czytko H. Jasmonate is involved in the induction of tyrosine aminotransferase and tocopherol biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Planta， 2002， 216（1）： 173-179.

[9] 郭新波， 唐岳立， 孫小芬， 等. 高等植物維生素C和維生素E代謝調(diào)控[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2011， 47（8）： 731-744.

[10] Riewe D， Koohi M， Lisec J， et al. A tyrosine aminotransferase involved in tocopherol synthesis in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2012， 5： 850-859.

[11] 胡英考， 李曉曉， 李雅軒， 等. 大豆酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2010， 30（6）： 1 092-1 098.

[12] Lopukhina A， Dettenberg M， Weiler E W， et al. Cloning and characterization of a coronatine-regulated tyrosine aminotransferase from Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2001， 126（4）： 1 678-1 687.

[13] Kim Y B， Uddina M， Kim Y， et al. Molecular cloning and characterization of tyrosine aminotransferase and hydroxyphenylpyruvate reductase， and rosmarinic acid accumulation in Scutellaria baicalensis[J]. Natural Product Communications， 2014， 9（9）： 1 311-1 314.

[14] Huang B， Yi B， Duan Y， et al. Characterization and expression profiling of tyrosine aminotransferase gene from Salvia miltiorrhiza（Dan-shen）in rosmarinic acid biosynthesis pathway[J]. Molecular Biology Reports， 2008， 35（4）： 601-612.

[15] 呂曉玲， 郝 磊， 王 芳， 等. 紫蘇酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因片段的克隆及表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（24）： 207-212.

[16] Lu X， Hao L， Wang F， et al. Molecular cloning and overexpression of the tyrosine aminotransferase（TAT）gene leads to increased rosmarinic acid yield in Perilla frutescens[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2013， 115（1）： 69-83.

[17] 申艷紅， 陳曉靜. 改良熱硼酸小量法提取番木瓜果肉RNA[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)， 2009， 38（2）： 7-9.

[18] 申艷紅， 陳曉靜， 蔡雪玲， 等. 番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分離及表達(dá)分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2015， 42（9）： 1 789-1 797.

[19] 申艷紅， 陳曉靜， 何瑋毅， 等. 番木瓜肌動(dòng)蛋白CpActin基因的克隆及在果肉中的表達(dá)研究[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2010， 27（6）： 859-862.

[20] Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55： 373-399.

[21] Spiteller G. The relationship between changes in the cell wall， lipid peroxidation， proliferation， senescence and cell death[J]. Physiologia Plantarum， 2003， 119（1）： 5-18.

[22] An J F， Paull R E. Storage temperature and ethylene influence on ripening of papaya fruit[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science， 1990， 115（6）： 949-953.

[23] Fabi J P， Cordenunsi B R， de Mattos Barreto G P， et al. Papaya fruit ripening： response to ethylene and 1-methylcyclopropene （1-MCP）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（15）： 6 118-6 123.