王玉紅 金關榮 陶愛芬 祁建民

摘 要 以中國9個省份和地區(qū)的86份芥菜種質資源為供試材料，利用SRAP分子標記和DNA指紋圖譜分析軟件，繪制芥菜遺傳資源基因組DNA指紋圖譜。從270對SRAP引物中篩選出40對多態(tài)性明顯、條帶清晰的引物組合，對86份供試材料基因組DNA分子進行擴增，共擴增出632條譜帶，其中多態(tài)性條帶427條，多態(tài)性比率為67.56%，表明芥菜種質資源遺傳多樣性較豐富。以供試的86份芥菜種質資源的SRAP擴增條帶為基礎，建立供試材料擴增條帶指紋數(shù)據(jù)庫的Excel文件，然后利用自主開發(fā)的DNA指紋圖譜軟件，構建86份芥菜種質資源的DNA指紋圖譜，獲得了所有芥菜種質資源的分子“身份證”。結果表明，SRAP分子標記非常適合芥菜DNA指紋圖譜的構建。

關鍵詞 芥菜；種質資源；DNA指紋圖譜；SRAP標記

中圖分類號 S637 文獻標識碼 A

芥菜[Brassica juncea（L.） Czern et Coss]是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬的重要物種，是原產中國的重要蔬菜之一，具有重要的經濟價值，其栽培歷史悠久，分布廣泛，有十分豐富的品種和變種[1-2]。近年來，隨著分子標記技術的迅速發(fā)展，SSR[3]，RAPD[4-5]，ISSR[6]，AFLP[7]等分子標記技術已廣泛應用于芥菜遺傳多樣性的研究中，但SRAP分子標記應用于芥菜遺傳多樣性的分析目前僅見到李寧等[8]的報道。SRAP是一種操作簡單，重復性好，多態(tài)性高，擴增結果穩(wěn)定的高效分子標記方法[9]，已經成功應用于包括蕓薹屬在內的許多作物的遺傳多樣性研究上[10-11]。

DNA指紋圖譜是建立在DNA分子標記基礎之上，能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜。因其技術簡單、快速、穩(wěn)定，非常適合于品種資源的鑒定[12-14]。目前，該技術已在多種作物品種純度鑒定，品種分子身份證構建等方面得到廣泛應用，并發(fā)揮著越來越重要的作用[15-20]。芥菜變種豐富，僅從形態(tài)學上難以進行品種區(qū)分，因此采用SRAP分子標記方法繪制其DNA指紋圖譜，通過構建其獨特的“分子身份證”建立中國芥菜基因源的分子數(shù)據(jù)庫，對深化種質資源發(fā)掘利用、品種識別鑒定、種子純度鑒定等均有重要的科學意義和實際應用價值。但目前國內外鮮見關于芥菜種質資源DNA指紋圖譜繪制的報道，此方面的研究有待深入，因此本研究具有創(chuàng)新性和必要性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芥菜材料共86份（表1），有葉用、莖用、根用和瘤用4種類型，來源于中國東南部的福建、浙江及香港地區(qū)；西南部的廣西和重慶；中原以北的河南、北京和黑龍江等9個省份和地區(qū)。供試材料由浙江蕭山棉麻研究所和福建農林大學作物遺傳改良研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份材料在四葉期取5株單株幼嫩葉片混合，參照徐建堂等[21]改良的CTAB 法提取基因組DNA。用1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用蛋白質核酸檢測儀檢測其濃度和純度。

1.2.2 SRAP分子標記分析 選擇4份形態(tài)學差異明顯的芥菜種質：嚴選水東雞心芥菜、厘浦花芥菜、福上芥3和大光頭芥菜，對270對SRAP引物進行多態(tài)性篩選，共篩選出40對多態(tài)性理想的引物用于86份芥菜種質資源的PCR擴增。PCR反應總體系為15 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（由廈門泰京生物技術有限公司提供）7 μL，DNA模板75 ng 0.8 μL，引物0.5 μL。SRAP-PCR擴增反應程序參照Li等[22]提出的方法并作優(yōu)化改良，具體如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；35 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物在10%（W/V）非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。

1.2.3 DNA指紋圖譜構建 用DNA指紋圖譜分析軟件[16]對引物擴增序列中的特異性和共性做出明確的分析，并可進行物種識別。在相同遷移率位置上有擴增條帶記為1，無擴增條帶記為0，構建二元數(shù)據(jù)矩陣。將構建的二元數(shù)據(jù)矩陣導入DNA指紋圖譜分析軟件進行多態(tài)性和特異性分析，最終構建芥菜的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 SRAP分子標記引物篩選及擴增

利用40對SRAP多態(tài)性引物對86份芥菜材料進行擴增，共擴增出632條譜帶，其中多態(tài)性條帶427條，多態(tài)性比率為67.56%。引物Me12-Em3擴增出的條帶數(shù)最多，為21條。引物Me3-Em9和Me9-Em9擴增出的條帶數(shù)最少，均為11條。多態(tài)性最高的引物是Me1-Em8、Me1-Em13和Me2-Em17，多態(tài)性比率達100%，而Me1-Em13擴增出的條帶數(shù)多于Me1-Em8和Me2-Em17（表2）。這說明SRAP標記擴增效率高且多態(tài)性好。引物Me1-Em13對部分芥菜材料的擴增效果見圖1。

2.2 DNA指紋圖譜繪制結果分析

通過DNA指紋圖譜分析軟件繪制出了所有芥菜品種的SRAP指紋圖譜（圖2），揭示了本研究所有供試種質在分子水平上存在明顯的遺傳差異。在本試驗中僅用篩選出的40對多態(tài)性引物中的10對組合，就可以構建出86份芥菜種質的DNA指紋圖譜，其效率十分高，同時表明這86份芥菜種質在分子水平上存在明顯的遺傳差異性。其中，圓梗甜芥菜-1和圓梗甜芥菜-2，雪里蕻-2和雪里蕻-3，黃八仙和早花芥菜，福州蓋山芥菜和福州寬桿芥菜，厘蒲花芥菜和芥菜-1，黃茼菜和大頭菜-1等品種的DNA指紋圖譜僅存在一個譜帶位點上的差異，這說明它們的親緣關系較近，遺傳差異較小，但仍可鑒定或識別出其遺傳水平上的差異。由此可見，SRAP分子標記非常適合芥菜品種間的DNA遺傳差異鑒定和指紋圖譜的構建。

3 討論與結論

3.1 SRAP標記在芥菜DNA指紋圖譜繪制上的可行性

利用分子標記進行DNA 指紋的構建時，遵循的原則之一是利用盡量少的標記識別盡量多的品種，以降低成本和提高檢測效率，這就要求所用的標記多態(tài)性要好[20]。本研究表明，平均每對 SRAP多態(tài)性引物可擴增出15.8條條帶，其中多態(tài)性條帶比率為67.56%。尤其是引物Me1Em13能擴增出17條多態(tài)性條帶，并且可以同時區(qū)分52份芥菜種質。由此可見，SRAP標記能夠提供芥菜基因組DNA豐富的信息，是芥菜種質資源研究中快速、準確、有效的新技術。同時，SRAP分子標記重復性好，操作簡單，在基因組中分布均勻，引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，可用少量的引物組配得到多個引物對，提高了引物的使用效率，降低引物合成成本[23]。

3.2 SRAP分子標記在繪制DNA指紋圖譜上的運用

本試驗通過40對SRAP多態(tài)性引物進行芥菜種質資源分子標記分析，結果表明，僅用其中10對SRAP引物即可成功構建出國內86份芥菜種質的DNA指紋圖譜，表現(xiàn)出很高的鑒別效率，是目前國內關于芥菜種質資源DNA指紋圖譜構建的首次成功的探索性研究。試驗結果表明，SRAP分子標記是芥菜DNA指紋圖譜繪制的十分適用的技術。而指紋圖譜繪制編程軟件在本試驗中的成功應用也是本研究的一大特色。目前，該軟件已成功應用于黃麻[16]、紅麻[20]等作物指紋圖譜的繪制。其可對試驗中獲得的電泳圖的二元數(shù)據(jù)矩陣進行搜索、編輯和分析處理，實現(xiàn)了電腦快速計算、快出結果，大幅度減少了人工的觀察誤差和計算時間，具有較高的科學性和分析結果的可靠性，適合芥菜指紋圖譜分子數(shù)據(jù)庫的構建。本研究可為中國芥菜分子數(shù)據(jù)庫的建立和植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查及知識產權保護提供技術支撐。同時，可應用于商業(yè)化育種上品種知識產權的保護，可進一步提高中國植物品種管理和新品種保護的科學化、規(guī)范化水平。鑒于不同的分子標記各有獨特的優(yōu)點，對芥菜DNA指紋圖譜的構建影響可能不同，因此今后可以結合多種分子標記進行分析，為芥菜的遺傳資源的鑒定和保護利用等提供全面的分子水平上的信息。

本試驗利用SRAP分子標記繪制了86份中國芥菜種質基因組DNA指紋圖譜，是繪制芥菜種質資源分子身份證的一個重要突破。前人采用SRAP方法對芥菜種質資源進行了遺傳多樣性和親緣關系研究，表明SRAP分子標記可以用于芥菜種質的研究上[8]，但未見采用SRAP方法繪制芥菜DNA指紋圖譜的報道。林清等[24]采用5條 Scot標記引物繪制了46份芥菜種質的指紋圖譜，平均每條引物可鑒別9份種質。而本研究采用10對SRAP引物，成功繪制了86份芥菜種質的DNA指紋圖譜，平均每對引物可鑒別8.6份芥菜種質，與基于目的基因開發(fā)的Scot標記效率相當。綜上所述，SRAP分子標記在芥菜種質資源DNA指紋圖譜繪制和分子數(shù)據(jù)庫的建立上具有較大的技術優(yōu)勢。本研究為芥菜種質資源的鑒別、知識產權保護和有效利用等提供了有效方法，具有較重要的理論和實踐意義。

參考文獻

[1] 劉佩瑛. 中國芥菜[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 1996： 56-59.

[2] 劉 婷， 湯青林， 王志敏， 等. 正交設計優(yōu)化芥菜ISSR反應體系研究[J]. 西南師范大學學報（自然科學版）， 2009， 34（1）： 115-118.

[3] 付 杰. 中國芥菜遺傳多樣性與親緣關系研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2005： 11-32.

[4] 喬愛民， 劉佩瑛， 雷建軍. 芥菜16個變種的RAPD研究[J]. 植物學報， 1998， 40（10）： 915-921.

[5] Muhammad Ayub Khan， Malik Ashiq Rabbanl， Muhammad Munir， et al. Assessment of genetic variation within Indian mustard（Brassica juncea）germplasm using random amplified polymorphic DNA markers[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50（4）： 385-392.

[6] 宋 明， 劉 婷， 湯青林， 等. 芥菜種質資源的RAPD和ISSR分析[J]. 園藝學報， 2009， 36（6）： 835-842.

[7] 齊曉花. 中國芥菜系統(tǒng)進化研究及重要數(shù)量性狀的遺傳分析[D]. 杭州： 浙江大學， 2009： 1-53.

[8] 李 寧， 司 軍， 任雪松， 等. 芥菜種質資源遺傳多樣性和親緣關系的SRAP分析[J]. 中國蔬菜， 2014（5）： 26-33.

[9] 李巧燕， 林瑞慶， 朱興全. SRAP分子標記及其應用概述[J]. 熱帶醫(yī)學雜志， 2006， 6（4）： 467-469.

[10] 許曉燕， 余夢瑤， 羅 霞， 等. 利用AFLP和SRAP標記分析19株毛木耳的遺傳多樣性[J]. 西南農業(yè)學報， 2008， 21（1）： 121-124.

[11] 樊洪泓， 李廷春， 邱 婧， 等. 石斛屬幾種植物遺傳關系的SRAP和RAPD比較分析[J]. 中藥草， 2010 ， 41（4）： 627-632.

[12] 王 偉， 楊文鵬， 戴保威， 等. DNA指紋圖譜技術及其在玉米遺傳育種上的應用[J]. 種子， 2008， 7（1）： 46-50.

[13] 王忠華. DNA指紋圖譜技術及其在作物品種資源中的應用[J]. 分子植物育種， 2006， 4（3）： 425-430.

[14] 張采波， 張艷花， 劉和洋， 等. 利用SRAP和SSR標記構建空間誘變新選玉米自交系指紋圖譜[J]. 中國生物工程雜志， 2013， 33（10）： 103-110.

[15] 文雁成， 王漢中， 沈金雄， 等. SRAP和SSR標記構建的甘藍型油菜品種指紋圖譜比較[J]. 中國油料作物學報， 2006， 28（3）： 233-239.

[16] 巫桂芬， 徐鮮均， 徐建堂， 等. 利用SRAP、 ISSR、 SSR標記繪制黃麻基因源分子指紋圖譜[J]. 作物學報， 2015， 41（3）： 367-377.

[17] 宣繼萍， 章 鎮(zhèn)， 房經貴， 等. 蘋果品種ISSR指紋圖譜構建[J]. 果樹學報， 2002， 19（6）： 421-423.

[18] 李宏博， 龐斌雙， 劉麗華， 等. 河北區(qū)試小麥品種（系）DNA指紋圖譜構建及遺傳差異分析[J]. 生物技術通報， 201， 31（6）： 93-99.

[19] Qingcai ZHAN， Zifa XIAO， Keyong ZHU， et al. Construction of DNA fingerprint using SSR marker for hybrid rice cultivars approved by Hunan province[J]. Agricultural Biotechnology， 2012， 1（4）： 7-10， 14.

[20] 汪 斌， 祁 偉， 蘭 濤， 等. 應用ISSR分子標記繪制紅麻種質資源DNA指紋圖譜[J]. 作物學報， 2011， 37（6）： 1 116-1 123.

[21] 徐建堂， 祁建民， 方平平， 等. CTAB法提取紅麻總DNA技術優(yōu)化與ISSR和SRAP擴增效果[J]. 中國麻業(yè)科學， 2007， 29（4）： 179-183.

[22] Li G， Quiros C F. Sequence related amplified polymorphism（SRAP）a new marker system based on a simple PCR reaction： Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001（3）： 455-461.

[23] 孔祥彬， 張春慶， 許子鋒. DNA指紋圖譜技術在作物品種（系）鑒定與純度分析中的應用[J]. 生物技術， 2005（4）： 74-77.

[24] 林 清， 龍治堅， 韓國輝， 等. 基于SCoT標記的芥菜種質遺傳多樣性與指紋圖譜[J]. 中國蔬菜， 2013（12）： 31-39.