王玉紅 金關(guān)榮 陶愛芬 祁建民

摘 要 以中國(guó)9個(gè)省份和地區(qū)的86份芥菜種質(zhì)資源為供試材料，利用SRAP分子標(biāo)記和DNA指紋圖譜分析軟件，繪制芥菜遺傳資源基因組DNA指紋圖譜。從270對(duì)SRAP引物中篩選出40對(duì)多態(tài)性明顯、條帶清晰的引物組合，對(duì)86份供試材料基因組DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出632條譜帶，其中多態(tài)性條帶427條，多態(tài)性比率為67.56%，表明芥菜種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富。以供試的86份芥菜種質(zhì)資源的SRAP擴(kuò)增條帶為基礎(chǔ)，建立供試材料擴(kuò)增條帶指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的Excel文件，然后利用自主開發(fā)的DNA指紋圖譜軟件，構(gòu)建86份芥菜種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，獲得了所有芥菜種質(zhì)資源的分子“身份證”。結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記非常適合芥菜DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

關(guān)鍵詞 芥菜；種質(zhì)資源；DNA指紋圖譜；SRAP標(biāo)記

中圖分類號(hào) S637 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

芥菜[Brassica juncea（L.） Czern et Coss]是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬的重要物種，是原產(chǎn)中國(guó)的重要蔬菜之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其栽培歷史悠久，分布廣泛，有十分豐富的品種和變種[1-2]。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，SSR[3]，RAPD[4-5]，ISSR[6]，AFLP[7]等分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于芥菜遺傳多樣性的研究中，但SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于芥菜遺傳多樣性的分析目前僅見到李寧等[8]的報(bào)道。SRAP是一種操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，多態(tài)性高，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的高效分子標(biāo)記方法[9]，已經(jīng)成功應(yīng)用于包括蕓薹屬在內(nèi)的許多作物的遺傳多樣性研究上[10-11]。

DNA指紋圖譜是建立在DNA分子標(biāo)記基礎(chǔ)之上，能夠鑒別生物個(gè)體之間差異的DNA電泳圖譜。因其技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，非常適合于品種資源的鑒定[12-14]。目前，該技術(shù)已在多種作物品種純度鑒定，品種分子身份證構(gòu)建等方面得到廣泛應(yīng)用，并發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[15-20]。芥菜變種豐富，僅從形態(tài)學(xué)上難以進(jìn)行品種區(qū)分，因此采用SRAP分子標(biāo)記方法繪制其DNA指紋圖譜，通過構(gòu)建其獨(dú)特的“分子身份證”建立中國(guó)芥菜基因源的分子數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)深化種質(zhì)資源發(fā)掘利用、品種識(shí)別鑒定、種子純度鑒定等均有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但目前國(guó)內(nèi)外鮮見關(guān)于芥菜種質(zhì)資源DNA指紋圖譜繪制的報(bào)道，此方面的研究有待深入，因此本研究具有創(chuàng)新性和必要性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芥菜材料共86份（表1），有葉用、莖用、根用和瘤用4種類型，來(lái)源于中國(guó)東南部的福建、浙江及香港地區(qū)；西南部的廣西和重慶；中原以北的河南、北京和黑龍江等9個(gè)省份和地區(qū)。供試材料由浙江蕭山棉麻研究所和福建農(nóng)林大學(xué)作物遺傳改良研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 每份材料在四葉期取5株單株幼嫩葉片混合，參照徐建堂等[21]改良的CTAB 法提取基因組DNA。用1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度和純度。

1.2.2 SRAP分子標(biāo)記分析 選擇4份形態(tài)學(xué)差異明顯的芥菜種質(zhì)：嚴(yán)選水東雞心芥菜、厘浦花芥菜、福上芥3和大光頭芥菜，對(duì)270對(duì)SRAP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選出40對(duì)多態(tài)性理想的引物用于86份芥菜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為15 μL，其中2×Taq PCR Master Mix（由廈門泰京生物技術(shù)有限公司提供）7 μL，DNA模板75 ng 0.8 μL，引物0.5 μL。SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序參照Li等[22]提出的方法并作優(yōu)化改良，具體如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；35 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在10%（W/V）非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測(cè)。

1.2.3 DNA指紋圖譜構(gòu)建 用DNA指紋圖譜分析軟件[16]對(duì)引物擴(kuò)增序列中的特異性和共性做出明確的分析，并可進(jìn)行物種識(shí)別。在相同遷移率位置上有擴(kuò)增條帶記為1，無(wú)擴(kuò)增條帶記為0，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。將構(gòu)建的二元數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入DNA指紋圖譜分析軟件進(jìn)行多態(tài)性和特異性分析，最終構(gòu)建芥菜的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP分子標(biāo)記引物篩選及擴(kuò)增

利用40對(duì)SRAP多態(tài)性引物對(duì)86份芥菜材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出632條譜帶，其中多態(tài)性條帶427條，多態(tài)性比率為67.56%。引物Me12-Em3擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為21條。引物Me3-Em9和Me9-Em9擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，均為11條。多態(tài)性最高的引物是Me1-Em8、Me1-Em13和Me2-Em17，多態(tài)性比率達(dá)100%，而Me1-Em13擴(kuò)增出的條帶數(shù)多于Me1-Em8和Me2-Em17（表2）。這說明SRAP標(biāo)記擴(kuò)增效率高且多態(tài)性好。引物Me1-Em13對(duì)部分芥菜材料的擴(kuò)增效果見圖1。

2.2 DNA指紋圖譜繪制結(jié)果分析

通過DNA指紋圖譜分析軟件繪制出了所有芥菜品種的SRAP指紋圖譜（圖2），揭示了本研究所有供試種質(zhì)在分子水平上存在明顯的遺傳差異。在本試驗(yàn)中僅用篩選出的40對(duì)多態(tài)性引物中的10對(duì)組合，就可以構(gòu)建出86份芥菜種質(zhì)的DNA指紋圖譜，其效率十分高，同時(shí)表明這86份芥菜種質(zhì)在分子水平上存在明顯的遺傳差異性。其中，圓梗甜芥菜-1和圓梗甜芥菜-2，雪里蕻-2和雪里蕻-3，黃八仙和早花芥菜，福州蓋山芥菜和福州寬桿芥菜，厘蒲花芥菜和芥菜-1，黃茼菜和大頭菜-1等品種的DNA指紋圖譜僅存在一個(gè)譜帶位點(diǎn)上的差異，這說明它們的親緣關(guān)系較近，遺傳差異較小，但仍可鑒定或識(shí)別出其遺傳水平上的差異。由此可見，SRAP分子標(biāo)記非常適合芥菜品種間的DNA遺傳差異鑒定和指紋圖譜的構(gòu)建。

3 討論與結(jié)論

3.1 SRAP標(biāo)記在芥菜DNA指紋圖譜繪制上的可行性

利用分子標(biāo)記進(jìn)行DNA 指紋的構(gòu)建時(shí)，遵循的原則之一是利用盡量少的標(biāo)記識(shí)別盡量多的品種，以降低成本和提高檢測(cè)效率，這就要求所用的標(biāo)記多態(tài)性要好[20]。本研究表明，平均每對(duì) SRAP多態(tài)性引物可擴(kuò)增出15.8條條帶，其中多態(tài)性條帶比率為67.56%。尤其是引物Me1Em13能擴(kuò)增出17條多態(tài)性條帶，并且可以同時(shí)區(qū)分52份芥菜種質(zhì)。由此可見，SRAP標(biāo)記能夠提供芥菜基因組DNA豐富的信息，是芥菜種質(zhì)資源研究中快速、準(zhǔn)確、有效的新技術(shù)。同時(shí)，SRAP分子標(biāo)記重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，在基因組中分布均勻，引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，可用少量的引物組配得到多個(gè)引物對(duì)，提高了引物的使用效率，降低引物合成成本[23]。

3.2 SRAP分子標(biāo)記在繪制DNA指紋圖譜上的運(yùn)用

本試驗(yàn)通過40對(duì)SRAP多態(tài)性引物進(jìn)行芥菜種質(zhì)資源分子標(biāo)記分析，結(jié)果表明，僅用其中10對(duì)SRAP引物即可成功構(gòu)建出國(guó)內(nèi)86份芥菜種質(zhì)的DNA指紋圖譜，表現(xiàn)出很高的鑒別效率，是目前國(guó)內(nèi)關(guān)于芥菜種質(zhì)資源DNA指紋圖譜構(gòu)建的首次成功的探索性研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記是芥菜DNA指紋圖譜繪制的十分適用的技術(shù)。而指紋圖譜繪制編程軟件在本試驗(yàn)中的成功應(yīng)用也是本研究的一大特色。目前，該軟件已成功應(yīng)用于黃麻[16]、紅麻[20]等作物指紋圖譜的繪制。其可對(duì)試驗(yàn)中獲得的電泳圖的二元數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行搜索、編輯和分析處理，實(shí)現(xiàn)了電腦快速計(jì)算、快出結(jié)果，大幅度減少了人工的觀察誤差和計(jì)算時(shí)間，具有較高的科學(xué)性和分析結(jié)果的可靠性，適合芥菜指紋圖譜分子數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。本研究可為中國(guó)芥菜分子數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性審查及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐。同時(shí)，可應(yīng)用于商業(yè)化育種上品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，可進(jìn)一步提高中國(guó)植物品種管理和新品種保護(hù)的科學(xué)化、規(guī)范化水平。鑒于不同的分子標(biāo)記各有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)芥菜DNA指紋圖譜的構(gòu)建影響可能不同，因此今后可以結(jié)合多種分子標(biāo)記進(jìn)行分析，為芥菜的遺傳資源的鑒定和保護(hù)利用等提供全面的分子水平上的信息。

本試驗(yàn)利用SRAP分子標(biāo)記繪制了86份中國(guó)芥菜種質(zhì)基因組DNA指紋圖譜，是繪制芥菜種質(zhì)資源分子身份證的一個(gè)重要突破。前人采用SRAP方法對(duì)芥菜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，表明SRAP分子標(biāo)記可以用于芥菜種質(zhì)的研究上[8]，但未見采用SRAP方法繪制芥菜DNA指紋圖譜的報(bào)道。林清等[24]采用5條 Scot標(biāo)記引物繪制了46份芥菜種質(zhì)的指紋圖譜，平均每條引物可鑒別9份種質(zhì)。而本研究采用10對(duì)SRAP引物，成功繪制了86份芥菜種質(zhì)的DNA指紋圖譜，平均每對(duì)引物可鑒別8.6份芥菜種質(zhì)，與基于目的基因開發(fā)的Scot標(biāo)記效率相當(dāng)。綜上所述，SRAP分子標(biāo)記在芥菜種質(zhì)資源DNA指紋圖譜繪制和分子數(shù)據(jù)庫(kù)的建立上具有較大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。本研究為芥菜種質(zhì)資源的鑒別、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和有效利用等提供了有效方法，具有較重要的理論和實(shí)踐意義。

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