艾冰花， 艾麗花， 陳　琳， 李秉鈞， 馮俊榮， 韓龔文

(1煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺 264005；2 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；3龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東 龍口 265700)

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響應(yīng)面法優(yōu)化鲅魚抗氧化肽發(fā)酵條件

艾冰花1， 艾麗花2， 陳琳1， 李秉鈞1， 馮俊榮1， 韓龔文3

(1煙臺大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺 264005；2 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；3龍口市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，山東 龍口 265700)

摘要：為減少加工廢棄物蛋白所造成的環(huán)境污染，提高水產(chǎn)品的利用率，探索了回收利用鲅魚(Spanish mackerel)加工后富含蛋白質(zhì)的廢棄物，以尋找制備鲅魚抗氧化肽的最佳生產(chǎn)條件。借助Design-Expert數(shù)據(jù)處理軟件對蘇云金芽孢桿菌Hy-4發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽的條件進行優(yōu)化；在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計法對影響發(fā)酵制備鲅魚抗氧化肽的培養(yǎng)條件進行篩選。確定了影響發(fā)酵液總抗氧化活性的3個主要影響因素(P<0.5)為發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH和料液比；在此基礎(chǔ)上，利用最陡爬坡實驗逼近3個關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域，再利用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法進行回歸分析，通過求解回歸方程得到產(chǎn)抗氧化肽的最優(yōu)條件為：發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH 6.8，接種量2%，料液比1.45 g/50 mL，菌齡24 h。經(jīng)過驗證，發(fā)酵液總抗氧化活性達到537.73 U，較優(yōu)化前提高了57.2%，與回歸方程的預(yù)測值570.11 U相比，相對誤差為5.7%，說明模型能夠較好地預(yù)測菌株Hy-4發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽發(fā)酵液的總抗氧化性。

關(guān)鍵詞：鲅魚；抗氧化肽；發(fā)酵；響應(yīng)面法；總抗氧化活性

鲅魚(Spanish mackerel)加工廢棄物富含蛋白質(zhì)，采用微生物發(fā)酵的方法對其加以利用、制備抗氧化肽，可以提高蛋白質(zhì)的利用率，減少環(huán)境污染[1-2]。多種優(yōu)化方法已廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵，其中以響應(yīng)面法的效果最為顯著[3]，其特點是可以從眾多變量中快速篩選出主要影響因素，避免非重要因素造成時間和資源上的浪費[4]。本研究前期已經(jīng)篩選出一株具有一定酶解鲅魚蛋白酶活力的蘇云金芽孢桿菌Hy-4，并且發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中主要是多肽類物質(zhì)表現(xiàn)出總抗氧化活性。本試驗以發(fā)酵液經(jīng)離心過濾制得的抗氧化多肽溶液的粗品為研究對象，采用響應(yīng)面法，接種蘇云金芽孢桿菌Hy-4進行發(fā)酵，以尋找優(yōu)化產(chǎn)抗氧化肽的發(fā)酵條件，由此提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

1材料與方法

1.1試驗材料

材料與試劑：加工廢棄物來自于鲅魚加工后的邊角料(不含魚頭、鰭和內(nèi)臟)；蘇云金芽孢桿菌Hy-4取自本實驗室；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，購于天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

儀器與設(shè)備：LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；250HG型數(shù)顯光照振蕩培養(yǎng)箱(金壇市精達儀器制造廠)；H1650-W型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；V-1100D型可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1原料處理及發(fā)酵液制備

處理方法根據(jù)相關(guān)文獻[5-9]并稍作修改。(1)原料處理：原料絞碎→烘干(70 ℃，24 h)→打碎→第一次脫脂(乙醇原料比4：1)→第二次脫脂(異丙醇原料比2：1)→烘干(70 ℃，24 h)→過篩網(wǎng)(80目)。種子液培養(yǎng)基制備：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH 6.6，120 ℃滅菌30 min。(2)Hy-4號菌優(yōu)化前發(fā)酵條件：發(fā)酵時間48 h，溫度38 ℃，培養(yǎng)液初始pH 6.6，料液比1 g/50 mL，接種量2%，菌齡12 h。(3)發(fā)酵液制備：磷酸緩沖液(pH 6.6，0.05 mol/L)→滅菌(120 ℃，30 min)→接種→發(fā)酵→沸水浴滅酶(10 min)→離心(10 000 r/min，20 min)→發(fā)酵液。

1.2.2響應(yīng)面法優(yōu)化

優(yōu)化試驗中設(shè)定6個因素，即發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量、料液比及菌齡。以酶解物多肽的總抗氧化性為響應(yīng)指標(biāo)，在單因素發(fā)酵實驗的基礎(chǔ)上，先后采用Plackeet-Burman(PB)試驗(得到影響效應(yīng)最大的幾個因素)、最陡爬坡試驗(以此逼近響應(yīng)面試驗的中心點[10-12])、Box-Behnken(BBD)試驗(采用多元二次方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝[13])，最終得到優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件[14]。

1.2.3總抗氧化活性測定

參考吳永沛等[15]的方法，總抗氧化活性(總抗)的測定使用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒。按照說明書的步驟進行加樣，取樣量為0.2 mL。計算公式為：

MT-AOC=(A-A0)×(V1/V2)×N×V3×100/30式中：MT-AOC—總抗氧化能力，U；A—測定OD值；A0—對照OD值；V1—反應(yīng)液總量，mL；V2—取樣量，mL；N—樣本測試前稀釋倍數(shù)；V3—發(fā)酵液體積，mL。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

在固定發(fā)酵溫度38 ℃、pH6.6、接種量2%、料液比1 g/50 mL、菌齡12 h的條件下進行發(fā)酵試驗，考察不同發(fā)酵時間對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響[16]。如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，總抗氧化活性達到最高值。

固定發(fā)酵液初始pH 6.6，接種量2%，料液比1 g/50mL，12 h菌齡，發(fā)酵時間依單因素發(fā)酵時間所得最佳結(jié)果為準(zhǔn)，即48 h，考察不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響。如圖2所示，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，總抗最高。

圖1　發(fā)酵時間對總抗氧化活性的影響Fig.1　Effect of fermentation time on total antioxidant activity

圖2　發(fā)酵溫度對總抗氧化活性的影響Fig.2　Effect of fermentation temperature on total antioxidant activity

固定發(fā)酵溫度30 ℃，接種量2%，料液比1 g/50 mL，發(fā)酵時間48 h，菌齡12 h，考察不同初始pH對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響。如圖3所示，發(fā)酵液總抗在初始pH 6.6和7.8時出現(xiàn)高峰，考慮發(fā)酵后期pH會上升，因此確定最佳pH為6.6。

圖3　發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對總抗氧化活性的影響Fig.3　Effect of initial pH on total antioxidant activity

固定發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 6.6，料液比1 g/50 mL，發(fā)酵時間48 h，菌齡12 h，考察不同接種量對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響。如圖4所示，總抗在接種量為2%和6%時分別出現(xiàn)一個峰值(571.15 U，603.74 U)，考慮培養(yǎng)成本，確定2%為最佳值。

圖4　接種量對總抗氧化活性的影響Fig.4　Effect of inoculum quantity on total antioxidant activity

固定發(fā)酵溫度30 ℃，pH 6.6，接種量2%，發(fā)酵時間48 h，種齡12 h，考察不同料液比對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響。圖5所示，在料液比為1.25 g/50 mL時，發(fā)酵液總抗最高。

圖5　料液比對總抗氧化活性的影響Fig.5　Effect of material-solvent ratio on total antioxidant activity

固定發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間48 h，初始pH 6.6，料液比1.25 g/50 mL，考察不同菌齡對發(fā)酵液總抗氧化活性的影響。如圖6所示，在種子液菌齡為24 h時，總抗最高。

圖6　菌齡對總抗氧化活性的影響Fig.6　Effect of cell age on total antioxidant activity

2.2Plackett-Burman試驗結(jié)果

基于單因素試驗結(jié)果，以單因素的最佳值即發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30 ℃、培養(yǎng)基初始pH

6.6、接種量2%、料液比2.5%、菌齡24 h為中心點，分別設(shè)置各因素的高值和低值進行PB實驗[17]。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。在6個因素中，對發(fā)酵液抗氧化活性影響最大的3個因素依次為料液比、溫度、初始pH(表2)。由表3可知，方差分析模型的Prob(P)>F值(0.017 3)，表明除去其他3個因素后，所得到的回歸方程達到顯著水平。

2.3爬坡試驗結(jié)果

選擇料液比、溫度和初始pH進行爬坡試驗，以三者的效應(yīng)正負值確定爬坡方向，根據(jù)三者的影響大小設(shè)計步長[18]。試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。發(fā)酵液的總抗氧化活性最大值在第4次試驗附近，所以選擇試驗3的設(shè)定條件為響應(yīng)面試驗的中心點，進行Box-Behnken試驗。

2.4響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果分析

從Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果(表5)可知，模型顯著，回歸方程的失擬檢驗不顯著(P=0.540 0>0.05)，說明模型擬合度良好，可以用來描述此組試驗數(shù)據(jù)[19-20]。使用Design-Expert軟件對擬合方程進行優(yōu)化，即去掉AB、A2和B2項，得到編碼的擬合方程：

MT-AOC=475.53+8.63A+15.2B+51.76C-27.52AC+28.51BC-19.76C2式中：MT-AOC—總抗氧化能力，U；A—發(fā)酵溫度，℃；B—料液比，g/50 mL；C—培養(yǎng)基初始pH。

軟件預(yù)測的最佳發(fā)酵條件及總抗氧化性響應(yīng)值為：發(fā)酵溫度30 ℃，料液比2.9%，培養(yǎng)基初始pH 6.8，此時的總抗氧化性為570.11 U。

表1　Plackett-Burman試驗結(jié)果

表2　Plackett-Burman試驗效應(yīng)分析結(jié)果

表3　Plackett-Burman試驗方差分析結(jié)果

注：*表示差異顯著(P<0.05)

表4　最陡爬坡試驗結(jié)果

表5　Box-Behnken試驗方差分析結(jié)果

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)

采用預(yù)測的發(fā)酵條件，以及單因素中發(fā)酵時間、接種量、菌齡的最佳值進行發(fā)酵實驗，即發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃，培養(yǎng)基初始pH 6.8，接種量2%，料液比2.9%，菌齡24 h，驗證優(yōu)化后總抗氧化性的預(yù)測值。做3個重復(fù)試驗，每一個重復(fù)試驗做3個平行，最終得到發(fā)酵液總抗氧化性的平均值為537.73 U，與預(yù)測值570.11相比，相對誤差為5.7%。可見通過響應(yīng)面法優(yōu)化可顯著提高鲅魚發(fā)酵液抗氧化活性[21]。

胡煒東等[5]使用響應(yīng)面法優(yōu)化油莎豆粕蛋白抗氧化肽制備工藝所得到的DPPH自由基清除率，與理論值相比，相對誤差為0.44%。陳潔梅等[22]在利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化豆粕固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)大豆抗氧化肽的研究中，得到的總抗氧化活性的相對誤差為1.16%。相比而言，本研究相對誤差較大，這是由于試驗材料及試驗方法的不同所產(chǎn)生的。本試驗采用的是微生物發(fā)酵的方法，試驗過程的不可控因素很多，試驗結(jié)果即總抗氧化性的相對誤差在10%以內(nèi)都可被認(rèn)為誤差不大。因此也可以說明本試驗響應(yīng)值的實驗值與回歸方程的預(yù)測值吻合良好。

3結(jié)論

以總抗氧化活性為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合Plackeet-Burman試驗、最陡爬坡實驗和Box-Behnken試驗，對發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，最終確定了發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度30 ℃、料液比2.9%、培養(yǎng)基初始pH 6.8，在該條件下，以2%的接種量接種24 h菌齡的菌株Hy-4，發(fā)酵48 h，所得到的酶解物抗氧化多肽的總抗氧化活性從優(yōu)化前的342.02 U提高到537.73 U，增長了57.2%。驗證結(jié)果與預(yù)測值相比，相對誤差為5.7%，說明該模型能夠較好地預(yù)測菌株Hy-4發(fā)酵產(chǎn)抗氧化肽發(fā)酵液的總抗氧化性。

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Optimization of fermentation conditions of antioxidant peptides from Spanish mackerel by response surface methodology

AI Binghua1， AI Lihua2， CHEN Lin1， LI Bingjun1， FENG Junrong1， HAN Gongwen3

(1SchoolofOcean,YantaiUniversity,Yantai264005,China;2SchoolofLifeScience,YantaiUniversity,Yantai264005,China;3Longkouaquaculturetechnologyextendingstations,Longkou265700,China)

Abstract：In order to improve the utilization efficiency of aquatic products and reduce the environmental pollution caused by waste protein, this paper explored the retrieving and using of Spanish mackerel processing wastes that are rich in protein, thus to search for the optimum conditions for preparing antioxidant peptides from Spanish mackerel, reduce the production cost and improve the economic benefit. Using waste proteins from Spanish mackerel production as substrate and bacillus thuringiensis Hy-4 as fermentation strain, Design-Expert software was applied to optimize the conditions for antioxidant peptides production. On the basis of single factor experiments, Plackett-Burman design was utilized to evaluate the effects of six variables influencing antioxidant peptides preparation from Spanish mackerel, including fermentation time, fermentation temperature, initial pH, inoculum quantity, ratio of material to solvent and cell age. Among the six variables studied, fermentation temperature, initial pH and ratio of material to solvent had significant effects on the total antioxidant activity of fermentation solution (P<0.05). Steepest ascent method was used to approach the optimal region of the total antioxidant activity. The regression analysis was further carried out using Box-Behnken design and response surface analysis. By solving the regression equation, the highest antioxidant peptides production was obtained at fermentation time 48h, fermentation temperature 30 ℃，initial pH 6.8, inoculum quantity 2%, material-to-solvent ratio 2.9%, and cell age 24h. The total antioxidant activity of fermentation solution reached to 537.73U, increased by 57.2% compared to the initial 342.02U. Compared with the predicted value of regression equation 570.11U, the relative error is 5.7%, illustrating that the model can better predict the total antioxidant activity of fermentation solution fermented by Hy-4.

Key words：Spanish mackerel; antioxidant peptides; fermentation; response surface methodology; total antioxidant activity

中圖分類號：Q933

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-9580(2016)02-056-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-9580.2016.02.011

作者簡介：艾冰花(1990—)，女，碩士研究生，研究方向：水生生物學(xué)。E-mail：963007166@qq.com通信作者：李秉鈞(1961—)，男，教授，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)、遺傳育種學(xué)、海洋生物技術(shù)。E-mail：li6234307@163.com

基金項目：山東省科技發(fā)展計劃“水產(chǎn)加工廢棄物發(fā)酵法制取抗氧化肽的研究(2012GHY11515)”

收稿日期：2015-11-05修回日期：2016-03-02