李有富，李　輝，韓　濤，丁楠楠

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院，襄陽　441021)

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楊梅素誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡及凋亡通路的研究

李有富，李輝*，韓濤，丁楠楠

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院，襄陽441021)

摘要：目的研究楊梅素體外對人宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡及凋亡通路的影響。方法體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細胞，MTT和SRB法檢測細胞增殖抑制率；流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算機分析細胞周期；Western Blot法檢測caspase-3、caspase-9和survivin含量。結(jié)果楊梅素對HeLa細胞的體外增殖具有抑制作用，并具有濃度和時間依耐性；楊梅素體外誘導HeLa細胞凋亡，并將細胞周期阻滯在S期；楊梅素促進caspase-3和caspase-9蛋白表達，抑制survivin蛋白表達。結(jié)論楊梅素可抑制HeLa細胞的增殖，誘導其凋亡，其凋亡途徑同時涉及細胞內(nèi)途徑和細胞外途徑。

關鍵詞：楊梅素；HeLa細胞；增殖；凋亡；caspase-3；caspase-9；survivin

楊梅素(myricetin，Myr)化學名為 3，3，4，5，5，7-六羥基黃酮，異名為楊梅樹皮素、楊梅黃酮和楊梅酮，是多羥基黃酮類化合物，主要存在于楊梅樹的樹皮中[1]?，F(xiàn)有的研究表明，楊梅素具有廣泛的藥理作用，包括降血糖、護肝、抗氧化、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等多種生物學活性[2-3]，近年來其抗腫瘤作用備受關注，但是目前國內(nèi)學者對楊梅素的抗腫瘤活性及其機制研究較少。本研究主要觀察楊梅素對人宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡、細胞周期和信號通路等方面的影響，考察其誘導細胞凋亡的作用機制，為其抗腫瘤治療奠定基礎。

1儀器與材料

1.1儀器Multiskan Ascent酶標儀，美國Thermo Electron公司；CO2培養(yǎng)箱，法國JOUAN公司；SW-4J-1F凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TE2000-S型倒置顯微鏡，Nikow公司；TDL-5低速大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；96孔培養(yǎng)板，Coming公司。

1.2材料人宮頸癌HeLa細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所，用含體積分數(shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；楊梅素由本實驗室制備所得，批號20130727，質(zhì)量分數(shù)為98.1%(HPLC)；RPMI 1640培養(yǎng)液，GIBCO公司；胰酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)和SRB試劑均購于Sigma公司；survivin、caspase-3和caspase-9單克隆抗體購于Abcam公司；Western及IP細胞裂解液、蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、GAPDH抗體和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購于北京碧云天生物科技有限公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)將人宮頸癌HeLa細胞置于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清、質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1的青霉素以及質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2和95%的飽和濕度培養(yǎng)箱中，每隔3 d用胰蛋白酶消化后進行傳代，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，取處于對數(shù)生長期的細胞用于實驗研究。

2.2體外抗腫瘤作用2.2.1MTT法檢測對宮頸癌細胞增殖的影響收集處于對數(shù)生長期的HeLa細胞稀釋成1×105個·mL-1的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)

24 h。將楊梅素溶解于1640培養(yǎng)液中，分別加入96孔培養(yǎng)板，使每組楊梅素終質(zhì)量濃度分別為10，20，40，80，160和320 μg·mL-1，每組有6個平行孔，空白對照組加入1640培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)24，48和72 h時各取出一板，按照MTT法進行實驗：從各孔中吸取100 μL上清液，加入MTT 10 μL(終質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，再次培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 100 μL，微量振蕩器充分振蕩使其溶解，置于酶標儀上570 nm處測定A值。按照“細胞平均抑制率(%)=(1-給藥孔平均A值/對照孔平均A值)×100%”計算，以劑量和抑制率繪制各板生長曲線。

2.2.2SRB法檢測對宮頸癌細胞增殖的影響按照2.2.1項下方法將HeLa細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，24 h后加入楊梅素，分別培養(yǎng)24，48和72 h后，進行SRB法檢測：每孔加入預冷的體積分數(shù)為50%的三氯乙酸50 μL，固定，靜置5 min，將96孔板移至4 ℃下放置1 h；倒掉固定液，去離子水洗5遍，干燥后每孔加SRB液100 μL，室溫避光放置10 min；用10 mL·L-1的醋酸洗5遍，空氣干燥，加150 μL 10 mmol·L-1非緩沖Tris堿液(pH值為10.5)溶解，置于515 nm處測定A值。按照2.2.1項下方法繪制生長曲線。

2.3流式細胞術檢測對宮頸癌細胞凋亡和周期的影響將對數(shù)生長期的HeLa細胞調(diào)整濃度至1×106個·mL-1，接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后隨機分為40，80和160 μg·mL-1的楊梅素組和陽性對照順鉑組，對照組加1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中，48 h后消化洗滌細胞，用4 ℃冰箱中預冷的體積分數(shù)為70%的乙醇將HeLa細胞固定。檢測凋亡前，先離心棄去上清液，用PBS洗滌細胞后置于檸檬酸緩沖液中放置1 h以上，調(diào)整濃度為1×106個·mL-1左右，置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡率，用計算機分析細胞周期。

2.4Western Blot法檢測對宮頸癌細胞survivin、caspase-3和caspase-9含量的影響將4個質(zhì)量濃度組(0，20，40和80 μg·mL-1)的楊梅素分別作用于細胞48 h后，用胰酶消化細胞，按照總蛋白提取試劑盒說明書要求將消化后的HeLa細胞置于EP管中，加入100 μL細胞裂解液吹打使其均勻，置于冰上30 min，4 ℃ 以14 000 r·min-1離心10 min，取上清液，每管取30 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，SDS/PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，用體積分數(shù)為5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，二抗(1∶500)室溫孵育2 h，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色，結(jié)果進行灰度掃描分析，實驗重復3次。

3結(jié)果

3.1對HeLa細胞增殖的影響同時采用MTT法和SRB法 2種方法檢測楊梅素對HeLa細胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)2種方法結(jié)果一致，楊梅素體外能抑制HeLa細胞的增殖，各劑量楊梅素作用的細胞生長抑制率與同板上空白對照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)，不同板之間，同一質(zhì)量濃度組的抑制率隨著作用時間的延長而增大。因此可見楊梅素體外可抑制HeLa細胞的生長，并具有質(zhì)量濃度和時間依賴性。見圖1。

圖1MTT法和SRB法檢測楊梅素對HeLa細胞增殖的影響

A.MTT法;B.SRB法

Fig.1The impact of myricetin on proliferation of HeLa cells by MTT and SRB

A.MTT method;B.SRB method

3.2對HeLa細胞凋亡的影響各劑量組的楊梅素作用于HeLa細胞后，均能誘導其凋亡。質(zhì)量濃度為40，80和160 μg·mL-1的楊梅素誘導細胞凋亡率分別為24.70%，29.25%和35.18%，明顯高于對照組，細胞凋亡率隨著劑量的增加而明顯增加。見表1。

表1楊梅素對HeLa細胞凋亡的影響

Tab.1 The impact of myricetin on apoptosis of HeLa cells

±s，n=3)

注：與細胞對照組比較**P<0.01。

3.3對HeLa細胞周期的影響數(shù)據(jù)表明，楊梅素作用過的HeLa細胞，各細胞周期均發(fā)生變化，3組細胞的S期比例均有明顯增加，與對照組相比，P<0.05；S期所占比例隨藥物劑量的增加也增加；而G0～G1期和G2～M期比例則相應減少，但與對照組相比沒有顯著性差異。由此可推測，楊梅素通過將HeLa細胞周期阻滯于S期而抑制其增殖。見表2。

表2楊梅素對HeLa細胞周期的影響

Tab.2 The impact of myricetin on cell cycle of HeLa cells

±s，n=3)

注：與細胞對照組比較**P<0.01，*P<0.05。

3.4對survivin、caspase-3和caspase-9含量的影響見表3和圖2。結(jié)果顯示，楊梅素各組抑制survivin蛋白的表達，促進caspase-3和caspase-9的表達，與對照組相比，結(jié)果均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05，0.01或0.001)，同時具有劑量依賴性。

圖2楊梅素對HeLa細胞survivin、caspase-3和caspase-9和蛋白表達的影響

Fig.2 The impact of myricetin on the expressions of survivin，caspase-3 and caspase-9 of HeLa cells

表3楊梅素對HeLa細胞survivin,caspase-3和caspase-9蛋白表達的影響

Tab.3 The impact of myricetin on the expressions of survivin，caspase-3 and caspase-9 of HeLa cells

組別劑量/μmol·L-1蛋白表達水平survivin/ng·L-1caspase-3/pmol·L-1caspase-9/pmol·L-1細胞對照—513.03±21.0923.58±1.4222.97±1.84順鉑40313.10±21.48***24.17±1.6030.69±1.39**楊梅素10497.32±11.5126.32±0.82*27.78±1.37*楊梅素40296.64±33.96***31.44±2.89*30.43±1.03**楊梅素160282.30±25.64***38.90±0.92***36.84±1.55***

注：與細胞對照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4討論

宮頸癌嚴重危害婦女的健康，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其全球死亡率居女性腫瘤第2位[4]。宮頸癌的治療方法包括手術、放療、化療，但其不良反應較嚴重。隨著中藥有效成分在惡性腫瘤的輔助治療中逐漸被臨床工作者應用，越來越多的學者也致力于各種中藥有效成分抗腫瘤作用的研究[5-6]。楊梅素是廣泛存在于多種天然中草藥中的化學成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、毒性低等優(yōu)點，可作為一種潛在的抗腫瘤輔助藥物。因此，本文主要從凋亡機制及通路等方面研究楊梅素對宮頸癌HeLa細胞生長的影響。

本研究同時采用MTT法和SRB法2種方法觀察楊梅素對HeLa細胞增殖的影響。結(jié)果表明，楊梅素能夠明顯抑制HeLa細胞的生長，并且具有良好的劑量和時間依賴性，2種方法相互印證，楊梅素具有體外抗腫瘤作用，結(jié)果準確可靠。而流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，楊梅素處理過的細胞凋亡率明顯增加，它將細胞阻滯于S期，提示楊梅素通過影響細胞周期從而抑制HeLa細胞的生長。

凋亡是細胞在外界的影響下為了更好地適應在眾多基因調(diào)控下進行的程序性死亡過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關[7-8]。細胞的增殖和凋亡在正常機體內(nèi)應處于一種平衡狀態(tài)，若這種狀態(tài)被打破，可導致腫瘤的發(fā)生。國內(nèi)外研究表明，機體可通過caspase依賴途徑以及非caspase依賴途徑誘導細胞凋亡，caspase家族是引起細胞凋亡的關鍵執(zhí)行者。激活caspase家族又分為細胞內(nèi)信號途徑(線粒體通路)和細胞外信號途徑(死亡受體通路)。細胞內(nèi)信號途徑通過線粒體釋放促凋亡分子(如細胞色素C)進入細胞質(zhì)，其與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成多聚復合體，激活caspase-9，導致DNA降解和染色體濃縮，從而啟動細胞凋亡[9]。細胞外信號途徑中細胞外部因子激活caspase家族中成員，無活性前體pro-caspase-3被激活剪切，形成活性片段cleaved caspase-3，再激活下游的caspase家族，最終引起細胞凋亡[10]。caspase-3是細胞凋亡過程中主要的效應因子，大多數(shù)細胞凋亡途徑均通過caspase-3誘導的信號傳遞過程[11]。survivin是重要的凋亡抑制蛋白，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用，從而促進腫瘤細胞的增殖。survivin還可通過抑制凋亡終末效應酶Caspase-3活性而減少caspase依賴途徑誘導的細胞凋亡，survivin基因表達水平下調(diào)還可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[12-13]。

本研究采用Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，楊梅素在誘導HeLa細胞凋亡的同時，能夠通過活化基因蛋白caspase-3、caspase-9，抑制survivin蛋白從而促進細胞凋亡，且具有劑量依賴性，提示楊梅素可同時通過細胞內(nèi)途徑和細胞外途徑誘導HeLa細胞凋亡。但是誘導細胞凋亡的過程極其復雜，可能還涉及其他的基因蛋白，還需進一步研究。

參考文獻：

[1]Liu I M，Tzeng T F，Liou S S，et a1. Myricetin a naturally occurring flavonol，ameliorates insulin resistance induced by a high-fructose diet in rats[J]. Life Sci，2007，81(21/22):1479-1488.

[2]林國鋇，謝燕，李國文．楊梅素的研究進展[J]．國際藥學研究雜志，2012，39(6):483-487.

[3]Bian J，Gu M，Hou S Y，et a1.Invitroresearch on function and mechanism of myricetin-mediated apoptosis of human liver cancer cell line HepG2[J]. China Med Herald，2012，9(36):7-9.

[4]Dehari R，Nakamura Y，Okamoto N，et a1. Increased nuclear expression of growth receptor in uterine cervical neoplasms of women under 40 years old[J]. Tohoko J Exp Med，2008，216(2):165-172.

[5]史海敏，丁庫克，張新．中藥有效成分影響宮頸癌HeLa細胞凋亡機制的研究進展[J]．環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8(1):124-127.

[6]陸文總，楊亞麗，賈光鋒，等．桔梗多糖對U-14宮頸癌抗腫瘤作用的研究[J]．西北藥學雜志，2013，28(1):43-45.

[7]商瀟云，李鑫，于波，等．甘草提取物(GC-3)體外誘導HeLa細胞凋亡及機制研究[J]．中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2013，7(23):10798-10801.

[8]易嵐，伍尤華，譚暉，等．Rac2在二烯丙基二硫誘導人白血病K562細胞凋亡中的作用[J]．西北藥學雜志，2014，29(5):472-477.

[9]劉躍亮，羅進勇，張彥，等．雙氫青蒿素對人骨肉瘤細胞株143B增殖和凋亡的作用[J]．中國藥理學通報，2012，28(12):1719-1723．

[10]劉金娟，楊成流，蔣繼宏，等．魚腥草地下莖提取物誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡機制的研究[J]．中國藥理學通報，2014，30(2):257-261.

[11]Ulukaya E，Acilan C，Yilmaz Y. Apoptosis:why and how does it occurin biology [J]. Cell Biochem Funct，2011，29(6):468-480.

[12]鄭志宏，潘云苓，陳英玉，等．志苓膠囊通過激活Caspase-3抑制K562細胞增殖和誘導細胞凋亡[J]．中國藥理學通報，2009，25(9):1244-1247.

[13]何小婷，李娟，柴曉靜，等.survivin基因在急性白血病患者中的表達及其臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014，22(2):408-412.

Effects of myricetin on apoptosis and apoptosis pathway of human cervical cancer HeLa cells

LI Youfu，LI Hui*，HAN Tao，DING Nannan

(Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441021，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the activity of myricetin on proliferation，apoptosis and to study the apoptosis signaling pathway on human cervical cancer HeLa cells. MethodsHeLa cells were cultured in vitro，and MTT and SRB were performed to observe the proliferation. Flow cytometry was utilized to measure the apoptosis and analysis of the cell cycle. The expressions of caspase-3,caspase-9 and survivin were determined by Western Blot. ResultsMyricetin could inhibit the proliferation of HeLa cells in vitro，in a concentration and time-dependent manner. Myricetin could elevate the apoptosis rates，and cell cycle was blocked in S phase. Myricetin was able to promote the expressions of caspase-3 and caspase-9，inhibit the expression of survivin. Conclusion Myricetin could inhibit the proliferation of HeLa cells，induce apoptosis，and the apoptosis pathway propably involves both intracellular and extracellular pathways.

Key words:myricetin；HeLa cells；proliferation；apoptosis；caspase-3；caspase-9；survivin

(收稿日期：2015-07-01)

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0270-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.015

*通信作者：李輝，女，主管藥師

作者簡介：李有富，男，主管藥師