史　婷，郝雙利，張志琪

(藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西安　710062)

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扁杏仁肽對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響

史婷，郝雙利，張志琪*

(藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西安710062)

摘要：目的探究扁杏仁肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cells， HUVECs)內(nèi)皮功能的影響。方法體外培養(yǎng)HUVECs，以150，300和600 μg·mL-1不同劑量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽給藥，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)增殖試驗(yàn)及細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET)含量的檢測(cè)。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組相比，所有劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽對(duì)HUVECs均有顯著的抑制作用(P<0.01)，同時(shí)顯著地減弱去甲腎上腺素對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(P<0.01)；在不同劑量扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽干預(yù)下培養(yǎng)細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中NO含量顯著升高、ET含量顯著降低(P<0.01)，同時(shí)對(duì)去甲腎上腺素具有顯著的拮抗作用(P<0.01)。結(jié)論扁杏仁全肽特別是扁杏仁谷蛋白肽對(duì)血管內(nèi)皮功能具有很強(qiáng)的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：扁杏仁全肽；扁杏仁谷蛋白肽；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；內(nèi)皮素；一氧化氮

血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)表面的單層細(xì)胞，覆蓋于整個(gè)血管系統(tǒng)的內(nèi)表面[1]，它不僅為血液流動(dòng)提供光滑的表面，還可調(diào)節(jié)血管張力，血管內(nèi)皮功能障礙是高血壓發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)[2]。高血壓患者因內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致一氧化氮(NO)釋放減少，內(nèi)皮素(ET)釋放量增加[3-4]。已有報(bào)道，扁杏仁肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)抑制作用[5-6]，本研究采用扁杏仁肽對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作用，通過細(xì)胞增殖和測(cè)定釋放一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(ET)量，探討其對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響，以期為扁杏仁降壓肽藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器C-W10XB/22型倒置光學(xué)顯微鏡，1.0 R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(日本Nikon公司)；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)；URIT-660型酶聯(lián)免疫分析儀(大連優(yōu)利特科技發(fā)展有限公司)。1.2試藥扁杏仁全肽(以陜北扁杏仁為原料，提取蛋白，經(jīng)復(fù)合蛋白酶Protamex和堿性內(nèi)切酶Alcalase雙酶水解獲得)；扁杏仁谷蛋白肽(以扁杏仁谷蛋白為原料，經(jīng)堿性內(nèi)切酶Alcalase酶解、超濾過1K膜、凍干獲得，經(jīng)鑒定其對(duì)ACE 的IC50=96.03 μg·mL-1)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng))。高糖DMEM(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(蘭州民海生物技術(shù)研究所)；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮(MTT，美國(guó)Sigma公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司)；卡托普利(Cap)和去甲腎上腺素(NE)購(gòu)于中國(guó)食品藥品鑒定所；一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物工程研究

所)；內(nèi)皮素(ET)Elisa試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1HUVECs的培養(yǎng)按一般細(xì)胞培養(yǎng)方法接種、培養(yǎng)，培養(yǎng)液為高糖DMEM+20%胎牛血清，隔天更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合長(zhǎng)至覆蓋瓶底80%～90%時(shí)，用胰酶消化法對(duì)細(xì)胞按1∶2的比例進(jìn)行傳代。

2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVECs，用PBS沖洗后，胰酶消化，制成 1×104個(gè)·mL-1或1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，隨機(jī)分為11組。(1)空白對(duì)照組：不加任何干預(yù)因素；(2)～(11)組為實(shí)驗(yàn)組，其中(2)～(4)為扁杏仁全肽實(shí)驗(yàn)組：低、中、高劑量扁杏仁全肽質(zhì)量濃度分別為150，300和600 μg·mL-1；(5)～(7)為扁杏仁谷蛋白肽實(shí)驗(yàn)組：低、中、高劑量扁杏仁谷蛋白肽質(zhì)量濃度分別為150，300和600 μg·mL-1；(8)為卡托普利陽(yáng)性對(duì)照組(Cap組)：Cap濃度為10-5mol·L-1；(9)為去甲腎上腺素組(NE組)：NE質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1；(10)為扁杏仁全肽+NE組：扁杏仁全肽與NE質(zhì)量濃度分別為300和100 μg·mL-1；(11)為扁杏仁谷蛋白肽+NE組：扁杏仁谷蛋白肽與NE質(zhì)量濃度分別為300和100 μg·mL-1。

2.3MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖將1×104個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，空白對(duì)照組加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組(2)～(11)按分組要求分別加入同體積的不同干預(yù)因素。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液。每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物質(zhì)充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%

2.4NO和ET含量測(cè)定將1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按分組要求分別加入不同干預(yù)因素，分別繼續(xù)培養(yǎng)10，24和48 h，收集培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書測(cè)定NO和ET含量。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1扁杏仁肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響在倒置相差顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組HUVECs接種后 6 h內(nèi)，細(xì)胞基本伸展貼壁，呈現(xiàn)單層扁平狀；12 h后HUVECs生長(zhǎng)旺盛，多角形細(xì)胞顯單層、鋪路石狀鑲嵌排列，核分裂相多見，1～2個(gè)核仁，胞漿豐富；72 h后細(xì)胞融合達(dá)85%左右。用MTT染色后測(cè)定的細(xì)胞增殖率如表1所示。

表1扁杏仁肽對(duì)HUVECs相對(duì)增殖率(%)的影響

Tab. 1 Influence of almond peptide on the relative growth rate(%) of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△△P<0.01。

由表1可見，與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，除低劑量扁杏仁全肽的抑制生長(zhǎng)作用不顯著、中劑量扁杏仁全肽和低劑量扁杏仁谷蛋白肽抑制生長(zhǎng)作用顯著(P<0.05)外，卡托普利及其他劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽對(duì)HUVECs均有極顯著的抑制生長(zhǎng)作用(P<0.01)；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間達(dá)48 h時(shí)，卡托普利及所有劑量的扁杏仁全肽和扁杏仁谷蛋白肽均對(duì)HUVECs有極顯著的抑制作用(P<0.01)；去甲腎上腺素(NE組)可極顯著地促進(jìn)HUVECs生長(zhǎng)，但與中劑量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽同時(shí)作用時(shí)，作用極顯著地減弱(P<0.01)。

3.2扁杏仁肽對(duì)一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素(ET)含量的影響見表2。

表2扁杏仁肽對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中NO含量(μmol·mL-1)的影響

Tab.2 Influence of almond peptide on the releasing NO of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△P<0.05，△△P<0.01。

與空白對(duì)照組比較，卡托普利及不同劑量的扁杏仁全肽、扁杏仁谷蛋白肽均可升高HUVECs培養(yǎng)液中NO含量、顯著降低ET含量(P<0.01)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，作用越強(qiáng)；卡托普利和扁杏仁谷蛋白肽的作用明顯強(qiáng)于扁杏仁全肽，見表2～3。

表3扁杏仁肽對(duì)HUVECs培養(yǎng)液中ET含量(pg·mL-1)的影響

Tab.3 Influence of almond peptide on the releasing ET of HUVECs

±s，n=6)

注：與空白對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01；與NE組比較△P<0.05，△△P<0.01。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲腎上腺素(NE組)可極顯著地降低HUVECs培養(yǎng)液中NO含量，促進(jìn)ET分泌；中劑量扁杏仁全肽或扁杏仁谷蛋白肽對(duì)去甲腎上腺素具有顯著的拮抗作用，中劑量扁杏仁谷蛋白肽與去甲腎上腺素合用，可使培養(yǎng)液中NO含量和ET值接近空白對(duì)照(P>0.05)。

4討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要功能之一是分泌血管舒縮活性物質(zhì)，并借此來調(diào)節(jié)血管張力及血流量[7]。其中NO 是目前所知的最重要內(nèi)皮舒張因子[2]；ET是內(nèi)皮血管收縮因子，具有強(qiáng)大的血管收縮功能[8]。作為維持血管舒縮功能的重要活性物質(zhì)，ET 和 NO 在正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡[9]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，釋放的很多活性物質(zhì)如凝血酶、腺苷二磷酸、三磷酸腺苷、5-羥色胺等，破壞了自身調(diào)節(jié)體系平衡，使得 ET合成增多、 NO的合成和釋放減少，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降， 血管壁結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致血壓升高[10]。本實(shí)驗(yàn)研究中，扁杏仁肽對(duì)HUVECs具有極顯著地抑制生長(zhǎng)作用，能夠促進(jìn)HUVECs分泌NO，減少ET分泌；同時(shí)，扁杏仁肽可減輕去甲腎上腺素(NE)引起的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)去甲腎上腺素抑制NO分泌、促進(jìn)ET分泌具有顯著地拮抗作用。這些研究結(jié)果表明，扁杏仁肽對(duì)血管內(nèi)皮功能具有保護(hù)作用，且具有與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物卡托普利相似的降壓機(jī)制。這為扁杏仁肽特別是扁杏仁谷蛋白肽降壓藥物的開發(fā)和利用提供了參考依據(jù)。

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The protective effect of peptides derived from sweet almond on endothelial function

SHI Ting，HAO Shuangli，ZHANG Zhiqi*

(Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi′an 710062， China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of sweet almond peptides on the endothelial function of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs). MethodsHUVECs were treated with different doses of the almond wholly peptides and the almond glutelin peptides (150，300 and 600 μg·mL-1)， and then the growth experiment of cells was carried out and the amount of NO and ET in culture media were measured.ResultsAlmond wholly peptides and the almond glutelin peptides could significantly inhibit the HUVEC growth， promote the NO releasing and reduce the ET level(P<0.01)，and significantly antagonize the effect of noradrenalin.ConclusionThe sweet almond peptides， especially the almond glutelin peptides， have strong protective action on the endothelial function of HUVECs.

Key words:sweet almond wholly peptides；almond glutelin peptides；human umbilical vein endothelium cells；endothelin；nitric oxide

(收稿日期：2015-10-14)

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0267-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.014

*通信作者：張志琪，男，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡(jiǎn)介：史婷，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2008K01-23)