彭小芳，郝　順，林　嚴(yán)，莫鎮(zhèn)濤，陳　陽，李文娜

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，珠海　519041)

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·藥物分析·

UPLC法快速測定梔子復(fù)方制劑中梔子苷和西紅花苷-1含量

彭小芳，郝順，林嚴(yán)，莫鎮(zhèn)濤，陳陽，李文娜*

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)藥理教研室，珠海519041)

摘要：目的建立快速測定梔子復(fù)方制劑復(fù)方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊中梔子苷和西紅花苷-1的方法。方法采用UPLC法。色譜柱為 BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-水以不同梯度洗脫；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：0～7 min為238 nm，7～20 min為440 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。結(jié)果3種復(fù)方制劑中梔子苷在0.010～1.000 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率分別為98.2%，99.9%和100.3%，RSD分別為1.3%，1.4%和1.0%；西紅花苷-1在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)。平均回收率分別為99.6%，97.4%和98.3%，RSD分別為1.3%，1.4%和1.5%。結(jié)論梔子苷和西紅花苷-1在20 min內(nèi)獲得良好分離，該方法簡便、準(zhǔn)確、快速，可用于梔子復(fù)方制劑中梔子苷和西紅花苷-1的測定。

關(guān)鍵詞：梔子苷；西紅花苷-1；梔子復(fù)方制劑；超高效液相色譜法

梔子來源于茜草科植物梔子的藥用果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效。梔子苷和西紅花苷是梔子的主要化學(xué)成分[1]。梔子苷具有抗炎、利膽等作用[2-3]；西紅花苷在抗炎、防治心血管疾病等方面具有明確的藥理作用[4-5]。龍澤熊膽膠囊(含有龍膽、地黃、梔子、黃連、大黃等17味中藥)有清熱散風(fēng)、止痛退翳之功效；復(fù)方牛黃消炎膠囊(含有人工牛黃、梔子、珍珠母等11味中藥)具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的功效；清胃黃連丸(含有黃連、地黃、知母、梔子等14味中藥)具有清胃瀉火、解毒消腫之功效?！吨袊幍洹?010年版規(guī)定龍澤熊膽膠囊以龍膽苦苷為檢測標(biāo)準(zhǔn)；復(fù)方牛黃消炎膠囊和清胃黃連丸均以檢測鹽酸小檗堿為檢測標(biāo)準(zhǔn)[6]。梔子也是3種中成藥的重要組分之一，其有效成分(梔子苷和西紅花苷)的含量可直接影響藥物的藥效，現(xiàn)行藥典采用HPLC法測

定梔子苷的含量而未檢測西紅花苷的含量。因此，本文采用UPLC法同時(shí)測定3種中成藥中梔子苷和西紅花苷-1的含量，為補(bǔ)充、完善含有梔子苷和西紅花苷的中成藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器 超高效液相色譜儀(美國Waters公司，配有Waters Acquity UPLC BEH Shield RP C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱、四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站)。KQ3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS 205電子天平(METTLER TOLEDO儀器有限公司)。

1.2試藥 梔子苷對照品(西安開來生物工程有限公司，批號K130116)；西紅花苷-1(crocin-1)為本實(shí)驗(yàn)室自制[7]。龍澤熊膽膠囊(吉林真元制藥有限公司，批號20130101)；復(fù)方牛黃消炎膠囊(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號WLE 12003)；清胃黃連丸 (山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號20140301)。甲醇為色譜純(Merck)；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的制備2.1.1對照品溶液的制備精密稱取對照品梔子苷和西紅花苷-1適量，分別加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇配制成1.000 0 mg·mL-1的梔子苷和10.0 μg·mL-1的西紅花苷-1混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備成藥分別研碎，精密稱定0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液，超聲提取20 min，取出，定容至刻度。振搖均勻，取液層，以8 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm的濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.2色譜條件C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱。流動相為水(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～5 min，90%～82%A；5～13.3 min，82%～62%A；13.3～16.7 min，62%～50%A；16.7～19 min，50%～90%A)。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：0～7 min，238 nm；7～20 min，440 nm；進(jìn)樣量：2 μL。對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1UPLC圖

A.梔子苷、 西紅花甘-1混合對照品; B.復(fù)方牛黃消炎膠囊; C.清胃黃連丸; D.龍澤熊膽膠囊; 1.梔子苷;2.西紅花苷-1

Fig.1 UPLC chromatograms

A.the standard products of geniposide and crocin-1;B.Niuhuangxiaoyan Capsules;C.Qingweihuanglian Pills;D.Longzexiongdan Capsules; 1. geniposide;2. crocin-1

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性考察實(shí)驗(yàn)取2.1.1項(xiàng)下的梔子苷和西紅花苷-1對照品混合液0.5，1，2，4和8 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋至刻度，精確吸取2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以梔子苷質(zhì)量濃度(mg·mL-1)和西紅花苷-1質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、記錄峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，得梔子苷線性方程：Y=3 227.430 3X+2 307.3，r1=0.999 9；得西紅花苷-1線性方程：Y=73 813X+757，r2=0.999 9。表明梔子苷和西紅花苷-1分別在0.010～1.000 mg·mL-1和0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對照品混合溶液2 μL，按照2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定梔子苷和西紅花苷-1峰面積， RSD值分別為1.13%和1.01%，表明儀器精密度良好[8]。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照2.2項(xiàng)下色譜條件，分別在0.5，1，3，6和12 h精密吸取同一批次供試品溶液，測定梔子苷和西紅花苷-1的峰面積，計(jì)算RSD分別為2.12%和1.76%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定[9]。

2.3.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)按照2.2項(xiàng)下色譜條件，精密吸取 2.1.2項(xiàng)下制備的供試液6份，分別測定記錄峰面積，梔子苷峰面積RSD為1.68%(n=6)；西紅花苷-1峰面積RSD為1.34%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密吸取已知含量的3種樣品液，分別加入一定量的梔子苷和西紅花苷-1對照品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2項(xiàng)下的色譜條件測定含量，平行測定6份，計(jì)算加樣回收率。梔子苷在復(fù)方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸、龍澤熊膽膠囊的平均回收率分別為98.2%，99.9%和100.3%，RSD均小于2%(n=6)，見表1；西紅花苷-1的平均回收率分別為99.6%，97.4%和98.3%，RSD均小于2% (n=6)，見表2。

表1梔子苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests for geniposide

藥品稱樣量/g樣品中量/μg添加量/μg測出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%復(fù)方牛黃消炎膠囊0.1172.1170.0330.196.598.21.30.1169.5170.0334.198.40.1171.3170.0331.797.20.1170.4170.0337.799.20.1169.6170.0339.399.90.1168.0170.0331.298.0清胃黃連丸0.1866.4867.01764.6101.899.91.40.1868.7867.01747.8100.70.1867.6867.01720.799.20.1865.3867.01742.7100.60.1867.1867.01718.599.10.1866.9867.01697.597.9龍澤熊膽膠囊0.1190.2191.0378.599.3100.31.00.1190.8191.0381.099.80.1191.2191.0385.3100.80.1190.1191.0386.1101.30.1191.9191.0379.599.10.1191.8191.0388.5101.5

表2西紅花苷-1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of recovery tests for crocin-1

藥品稱樣量/g樣品中量/μg添加量/μg測出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%復(fù)方牛黃消炎膠囊清胃黃連丸龍澤熊膽膠囊0.12.15.07.14100.699.61.30.12.35.07.31100.10.12.05.06.8898.10.12.45.07.3399.00.11.95.06.8098.60.12.55.07.61101.40.112.112.023.8098.997.41.40.112.212.023.7098.00.112.712.023.7096.00.112.612.024.3098.80.112.312.023.3095.90.112.512.023.7096.80.10.010.09.8899.998.31.50.10.010.09.9099.00.10.010.09.7597.10.10.010.09.8497.20.10.010.09.8299.80.10.010.09.7896.7

2.4含量測定

供試品的含量測定在2.2項(xiàng)色譜條件下，取2.1.2項(xiàng)下制備的供試品溶液3份進(jìn)行分析，測定含量。復(fù)方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊UPLC含量測定中，梔子苷平均含量分別為0.170%，0.867%和0.191%；復(fù)方牛黃消炎膠囊和清胃黃連丸中西紅花苷-1的平均含量分別為0.002 2%和0.012 4%；龍澤熊膽膠囊未檢出西紅花苷-1。結(jié)果見表3。

表3樣品測定結(jié)果

Tab.3 The content of geniposide and crocin-1 in different samples

(n=3)

3討論

梔子不同的炮制方法呈現(xiàn)出不同療效，藥用成分也相應(yīng)地發(fā)生變化[10-13]。梔子苷是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷[14]，具有抗炎、解熱、利膽和輕瀉作用，是抗炎和治療軟組織損傷的主要成分。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)對梔子藥材和含有梔子藥材的部分中藥復(fù)方采取測定梔子苷的含量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但都沒有西紅花苷-1含量測定的規(guī)定，而中成藥中梔子苷和西紅花苷-1含量的高低可能會對成藥的療效產(chǎn)生一定影響。復(fù)方牛黃消炎膠囊、清胃黃連丸和龍澤熊膽膠囊均對呼吸道炎癥具有良好的療效。西紅花苷也是梔子藥材的主要成分和發(fā)揮各種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，西紅花苷具有明顯的抗炎作用。Xu等[15]研究表明，西紅花苷對CXO-1、COX-2酶具有雙重抑制作用。能劑量依賴性抑制二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足趾腫脹，明顯抑制對吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃炎模型中的胃病病損的進(jìn)展。藥理研究顯示，西紅花苷還具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、神經(jīng)保護(hù)和保護(hù)肝臟等作用[16-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定了梔子中梔子苷和西紅花苷中含量最高的西紅花苷-1(含量約為梔子藥材中總西紅花苷的87%)的含量，有利于更全面反映含梔子復(fù)方制劑的內(nèi)在品質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)建立了20 min內(nèi)快速鑒定并測定3種含梔子復(fù)方制劑中西紅花苷-1和梔子苷的方法。方法學(xué)研究表明，本方法準(zhǔn)確、簡便、快速，可作為梔子復(fù)方制劑中梔子苷和西紅花苷的含量測定方法。

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Simultaneous determination of crocin-1 and geniposide in Zhizi preparations by UPLC

PENG Xiaofang， HAO Shun， LIN Yan， MO Zhentao， CHEN Yang， LI Wenna*

(Department of Pharmacology， Zunyi Medical College， Zhuhai Campus， Zhuhai 519041， China)

Abstract:ObjectiveTo establish a fast method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in three kinds of traditional Chinese medicines by UPLC. MethodsUPLC was adopted in this study. The analytical column was BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) and gradient elution with methanol-H2O as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL·min-1. The detection wavelength was set at 238 nm (0-7 min) for geniposide and 440 nm (7-20 min) for crocin-1. The column temperature was 30 ℃and the injection volume was 2 μL. ResultsThe two components had a good linear relationship between 0.010-1.000 mg·mL-1and 0.1-10.0 μg·mL-1. The average recoveries (n=6) of geniposide and crocin-1 in three preparations were 98.2%，99.9% and 100.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.0%) and 99.6%，97.4% and 98.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.5%)， respectively. ConclusionThe separation of geniposide and crocin-1 only needs 20 min with accuracy and good reliability. The method is simple，specific and suitable for the simultaneous determination of the content of geniposide and crocin-1 in the three preparations.

Key words:geniposide;crocin-1; Zhizi preparation; UPLC

(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0245-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.007

*通信作者：李文娜，女，博士，碩士研究生導(dǎo)師

作者簡介：彭小芳，男，碩士研究生

基金項(xiàng)目：貴州省中藥現(xiàn)代化研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(編號：黔科合ZY字[2013]3018號)