戚文平，劉麗娟，李 宇，孫炳劍，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 河南鄭州 450002)

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用酵母雙雜交篩選與小麥黃花葉病毒CP互作的寄主因子

戚文平，劉麗娟，李 宇，孫炳劍，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 河南鄭州 450002)

摘要：為篩選與小麥黃花葉病毒外殼蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein， WYMV-CP)互作的小麥蛋白，構建了小麥莖葉酵母雙雜交cDNA文庫，并從中篩選獲得了與WYMV-CP互作的小麥蛋白基因片段。從小麥莖葉中提取小麥總RNA,分離mRNA后，利用GATE-WAY技術將反轉(zhuǎn)錄得到的小麥cDNA片段定向轉(zhuǎn)移到目的載體，同源重組反應后成功構建小麥cDNA文庫。經(jīng)檢測，小麥cDNA文庫的滴度為5.86×106 CFU·mL-1,庫容量為2.34×107 CFU,重組率為95.8%。根據(jù)NCBI上WYMV-CP開放閱讀框信息，構建了誘餌載體pGBK-CP，通過酵母雙雜交篩選獲得了若干陽性克隆，共轉(zhuǎn)化試驗初步驗證了WYMV-CP與PEPCK、PAL等蛋白的互作關系。本研究利用酵母雙雜交技術成功獲得與WYMV-CP互作的小麥蛋白基因片段，為明確WYMV的致病機制提供了科學的依據(jù)。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；外殼蛋白；cDNA文庫；酵母雙雜交

小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)成員之一[1]，由土壤中禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)進行傳播。在我國江蘇、河南、安徽、山東、陜西、湖北和四川等省均有分布，近年來，每年全國冬麥區(qū)發(fā)病面積超過50萬hm2，并呈逐年蔓延趨勢[2]。

酵母雙雜交技術作為快速檢測和鑒定蛋白質(zhì)相互關系的標準方法之一，已經(jīng)被廣泛應用于各類生物的蛋白質(zhì)互作的研究[3-4]。小麥黃花葉病毒外殼蛋白(Coat protein，CP)是病毒唯一的結(jié)構蛋白，也是病毒最重要的致病因子，在病毒的侵染過程中扮演多種角色。CP攜帶著與介體和寄主的識別信息，主要功能是包裝病毒粒子、參與介體傳播、病毒與寄主和介體識別、調(diào)節(jié)RNA復制、細胞間運動和系統(tǒng)侵染，尤其是對病毒侵染癥狀起決定作用。Li等[5]以番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)外殼蛋白為誘餌，利用酵母雙雜技術篩選煙草cDNA文庫，分離出一個激發(fā)子蛋白，該蛋白基因被沉默后，病毒粒子不能長距離運動，證實了該蛋白和病毒外殼蛋白互作有利于病毒運動。Okinaka等[6]利用酵母雙雜交技術，以雀麥花葉病毒(Brome mosaic virus, BMV)CP為誘餌，篩選大麥cDNA文庫，得到一個氧化還原酶基因HCP1。目前，國內(nèi)外關于WYMV-CP與寄主蛋白互作方面的研究較少[7-9]。本研究利用酵母雙雜交技術，從構建的小麥cDNA文庫中篩選出與WYMV-CP互作的寄主蛋白，以期為小麥黃花葉病毒的致病機制研究提供科學的依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為小麥品種中國春，于植株苗期自河南農(nóng)業(yè)大學科教園區(qū)實驗田采集，蒸餾水清洗干凈，保存于-80℃冰箱備用。

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH10B、DH5α購自北京全式金生物公司；CP抗血清由浙江省農(nóng)科院病毒與生物技術研究所陳劍平實驗室惠贈。

1.2方 法

1.2.1小麥cDNA文庫的構建

文庫構建參照Clontech Mate & PlateTM Library Construction方法進行。采用Trizol法[10]提取小麥總RNA, 溶解于50 μL RNase-free H2O后，用超微量分光光度計測量RNA樣品的純度和濃度。參照Fast Track MAG mRNA Isolation Kit說明書分離純化獲得的mRNA；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。初級文庫的構建參照CloneMiner的說明書進行操作。提取初級文庫質(zhì)粒稀釋到300 ng·μL-1, 進行LR重組反應到酵母雙雜交載體pGADT7-DEST上，電轉(zhuǎn)化于DH10B感受態(tài)細胞，獲得酵母雙雜交cDNA文庫。

文庫質(zhì)量鑒定：取轉(zhuǎn)化后細菌原液10 μL稀釋1 000倍后，吸取50 μL涂布于LB平板(Amp+)，第二天計數(shù)、檢查庫容量(平板上的克隆數(shù)/50×1 000×1×103×文庫菌液總體積)。從中隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，確定重組率和插入片段大小。

提取文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于酵母Y187感受態(tài)細胞中，獲得可以用于有性雜交的酵母文庫，1 mL分管裝備用。

1.2.2重組誘餌質(zhì)粒載體pGBKT7-CP的構建

根據(jù)WYMV-CP序列(GenBank：AJ131981)設計特異性引物CP-F:5′-GCATATGGCAGCT GACACACAAACAGA-3′, CP-R:5′-TAGATC TTTAGGTTAGTTCTGGGTGTCC-3′；以反轉(zhuǎn)錄小麥黃花葉病毒cDNA為模板擴增；擴增產(chǎn)物連接到載體pMD18-T后,轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細胞DH5α中，提取陽性克隆質(zhì)粒。利用NdeI和BglII雙酶切重組質(zhì)粒 pMD18-CP，用NdeI和BamHII雙酶切pGBKT7質(zhì)粒。酶切產(chǎn)物在T4連接酶作用下4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)DH5α中，篩選陽性克隆并送上海生工生物公司測序。

將空載體pGBKT7和重組質(zhì)粒pGBK-CP分別轉(zhuǎn)入Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞，涂布在SD(-Trp)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)兩種固體平板，30 ℃孵育2～3 d，觀察菌落形態(tài)及顏色，以此判斷誘餌質(zhì)粒是否對酵母菌株有自激活活性和毒性。SDS/尿素法提取酵母蛋白(按照Clontech：Yeast Protocols Handbook操作說明書進行操作)，以抗C-myc標簽兔多克隆抗體為一抗、HRP標記山羊抗兔多克隆抗體為二抗，對酵母蛋白進行WESTERN BLOT實驗。

1.2.3小麥cDNA文庫篩選

參照Clontech MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual方法進行，并稍做改進。從SD(-Trp)平板上挑取新鮮菌落，于50 mL SD(-Trp)液體培養(yǎng)基，30 ℃搖菌過夜，至OD600超過0.8。離心，棄上清，用SD(-Trp)液體培養(yǎng)基3 mL重懸浮。加入1 mL轉(zhuǎn)入了酵母Y187的cDNA文庫，混勻于45 mL的YPDA(含50 μg·mL-1Kan+)液體培養(yǎng)基中，30 ℃、40 r·min-1孵育20～24 h。離心，棄上清，用0.9%NaCL重懸。涂布于SD(-Trp/-Leu/-His)營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，30 ℃孵育2～3 d，將單克隆劃線于SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)平板上，30 ℃孵育2～3 d。提取陽性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5a，篩選陽性克隆送上海生工生物公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比對。

將測序正確的質(zhì)粒分別和pGBK-CP、pGBK-Lam共轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細胞，涂布于SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)固體平板，驗證互作結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1小麥cDNA的構建及鑒定

利用超微量分光光度計測定小麥總RNA及mRNA的D260、D280、D260/D280和濃度發(fā)現(xiàn)，小麥樣品總RNA的D260/D280為1.801 6，質(zhì)量濃度為1.375 μg·μL-1；mRNA的D260/D280為1.973 3，質(zhì)量濃度為0.975 μg·μL-1。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1)顯示，抽提的RNA樣品質(zhì)量較好，沒有發(fā)生明顯的降解。mRNA有一條彌散的帶，說明mRNA分離純化效果較好。獲得的RNA和mRNA完整性良好，可用于后續(xù)試驗。

M:1 kb DNA marker

試驗得到的cDNA文庫的滴度為5.86×106CFU·mL-1, 庫容量為2.34×107CFU，重組率為95.8%，成功構建了可以用于酵母雙雜交的cDNA文庫。挑取24個單克隆進行PCR檢測(圖2), 發(fā)現(xiàn)只有一個克隆插入了較小基因片段(小于1 kb)。

M:1 kb DNA對照；1～24:重組子　　　　M:1 kb DNA marker; 1-24:Recombinants

2.2誘餌載體的構建

目的片段連接到載體pMD18-T，經(jīng)NdeI和BglII雙酶切重組質(zhì)粒后，用T4連接酶連接到載體pGBKT7，獲得了插入目的片段的誘餌載體pGBK-CP。測序結(jié)果顯示，重組載體讀碼框正確，無移碼突變。將載體pGBK-CP、pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母Y2H Gold，轉(zhuǎn)化菌落可以在SD(-Trp)上產(chǎn)生白色菌落，且與對照相比，生長速度無明顯差別，但在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)上均不能生長(圖3)。經(jīng)Western檢測，誘餌載體能夠在酵母中正常表達(圖4)。這些結(jié)果說明誘餌載體沒有毒性和自激活活性，可以用于下一步篩選試驗。

A、C：攜帶pGBKT7的酵母在SD(-Trp)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)平板上；B、D:攜帶pGBK-CP的酵母在SD(-Trp)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)平板上

A,C：Yeast with pGBKT7 on the SD(-Trp) and SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL) plate; B,D:Yeast with pGBK-CP on the SD(-Trp) and SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL) plate

圖3pGBK-CP、pGBKT7載體自激活及毒性驗證

Fig.3Autoactivation and toxicity testing

of pGBK-CP、pGBKT7

圖4　　　pGBK-CP、pGBKT7載體在酵母中的表達

2.3與WYMV-CP互作寄主因子的篩選

誘餌載體篩選酵母文庫，從SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)固體培養(yǎng)基上篩選與WYMV CP互作蛋白。結(jié)果，共篩選到29個陽性克隆，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，25個克隆讀碼框正確，其中4個克隆為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)基因片段，1個克隆為苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase ，PAL)基因片段，1個克隆為葉綠體依賴ATP的FTSH 2蛋白酶(ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 2, chloroplastic)基因片段，3個克隆為TaENO-b烯醇激酶(TaENO-b enolase)基因片段，其余為未知功能的小麥基因片段。

3討 論

蛋白質(zhì)互作是目前生命科學研究的熱點，通過構建的cDNA文庫來篩選與動植物或病原體某個基因編碼的蛋白相互作用的寄主蛋白，是研究蛋白互作的有效手段。黃大輝等[11]系統(tǒng)闡述了利用酵母雙雜交技術來篩選與病毒蛋白相互作用的植物蛋白的研究進展。本研究利用GATE-WAY克隆技術構建了小麥的cDNA文庫，能夠最大限度的保證文庫容量，并且操作簡單，應用范圍廣，既提高了靈活性，又簡化了克隆工作流程[12]。

病毒在侵染植物過程中，其編碼的蛋白會與植物蛋白發(fā)生相互作用，以調(diào)控植物代謝及病毒侵染過程。Xie等[13]利用酵母雙雜交技術，以小麥矮縮雙生病毒(Wheat dwarf virus，WDV)復制酶A蛋白為誘餌，從小麥cDNA文庫中分離出一個名為GRAB的蛋白質(zhì)家族，并對其中的兩個成員進行了分子特征及功能分析，研究表明GRAB的表達能夠抑制病毒在小麥中的復制。病毒外殼蛋白通過與寄主蛋白相互作用影響病毒侵染、癥狀的產(chǎn)生及其在植物中的運動。目前國內(nèi)外關于小麥黃花葉病毒和寄主小麥之間的互作機制，尤其是對兩者蛋白之間互作的研究報道較少。本研究將小麥黃花葉病毒CP基因構建到誘餌載體上，對小麥cDNA文庫進行篩選，初步得到幾個有進一步研究意義的蛋白-磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苯丙氨酸解氨酶蛋白(PAL) 、TaENO-b烯醇激酶，這三個蛋白都與小麥的抗性有關。PEPCK為鈣依賴蛋白，催化底物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸化，為植物中最小的蛋白激酶，像植物中其他激酶一樣存在一個催化結(jié)構域，但是缺少和鈣結(jié)合的EF框架[14]。PAL在植物體內(nèi)的主要作用是催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸。Eck等[15]利用病毒介導的基因沉默技術(VIGS)將小麥PAL基因沉默后，小麥對蚜蟲的抗性明顯增強。葉綠體依賴ATP的FTSH 2蛋白酶可能影響葉綠體中葉綠素的合成，進而使小麥表現(xiàn)黃化癥狀。病毒外殼蛋白和這些代謝酶的相互作用，可能影響植物的營養(yǎng)代謝，使植物對病毒的抗性減弱。確定互作關系后，還需對小麥不同生長期這幾種小麥蛋白表達量的差異、蛋白的功能及蛋白與病毒互作對植物代謝和病毒侵染的影響進行研究，以更全面的了解病毒危害機理、制定控制措施。本研究發(fā)現(xiàn)的病毒CP和PEPCK、PAL等基因的互作現(xiàn)象，為進一步研究小麥黃花葉病毒外殼蛋白和寄主之間的分子作用機制提供了科學的依據(jù)。同時，本文構建的小麥全株cDNA文庫，也為病原體編碼蛋白與寄主小麥互作的研究奠定了基礎。

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Screening of Host Factors Interacting with Wheat Yellow Mosaic Virus CP by Yeast Two-hybrid System

QI Wenping,LIU Lijuan,LI Yu,SUN Bingjian,LI Honglian

(College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou,Henan 450002,China)

Abstract:In order to screen the wheat proteins which interact with the coat protein of wheat yellow mosaic virus, wheat cDNA library was constructed. And some wheat genes were screened from the cDNA library. After the separation of mRNA from wheat leaf and stem, the wheat cDNA fragments were directional transferred to the purpose vector using the GATE-WAY technology. Following the homologous recombination reaction, the wheat yeast two hybrid cDNA library was constructed. According to the open reading frame information of wheat yellow mosaic virus coat protein in NCBI, the bait vector pGBK-CP was constructed, and wheat protein genes interacting with wheat yellow mosaic virus coat protein were screened by yeast two-hybrid system, which were tested using co-transformation technology. After the detection, the titer of yeast two-hybrid cDNA library is 5.86×106 CFU·mL-1, and the capacity is 2.34×107 CFU, and recombination rate is 95.8%, which can be used in the yeast two-hybrid system. Several positive clones were obtained by the yeast two-hybrid screening, and the interaction relationship between wheat yellow mosaic virus coat protein and PEPCK, PAL proteins were confirmed through co-transformation test. This study provides more theory for explore WYMV pathogenic mechanism on the molecular level.

Key words:Wheat yellow mosaic virus; Coat protein; cDNA library; Yeast two-hybrid

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)04-0415-05

通訊作者：孫炳劍(E-mail:sbj8624@sina.com)

基金項目：NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項目(U1304322)；國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303021)

收稿日期：2015-11-30修回日期：2015-12-16

網(wǎng)絡出版時間：2016-04-01

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1529.008.html

第一作者E-mail：15517127870@163.com