徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

?

中國(guó)黃淮麥區(qū)菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體特異性SCAR標(biāo)記的建立

徐 姣，劉 佳，代君麗，李洪連

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450002)

摘要：菲利普孢囊線蟲(chóng)(Heterodera filipjevi)是在我國(guó)黃淮麥區(qū)新發(fā)現(xiàn)的小麥病原線蟲(chóng)，其致病力更強(qiáng)，危害更嚴(yán)重，對(duì)小麥產(chǎn)量和質(zhì)量造成潛在威脅。病原致病型鑒定對(duì)抗病品種的篩選和培育十分重要。為了建立一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的SCAR標(biāo)記檢測(cè)體系，以黃淮麥區(qū)5個(gè)重要禾谷孢囊線蟲(chóng)致病型共9個(gè)群體為材料，首先對(duì)其進(jìn)行RAPD分析，然后在RAPD分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行SCAR分析。結(jié)果表明，通過(guò)篩選97條隨機(jī)引物，獲得2個(gè)菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體特異的RAPD標(biāo)記，其中，引物S232擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶大小為550 bp，引物S278擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶大小為1 700 bp。其后將引物S232擴(kuò)增的條帶進(jìn)行回收、克隆及測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)的特異性引物F232-8-1/R232-8-1僅在菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體中擴(kuò)增出大小為517 bp的特異性條帶，而在小麥孢囊線蟲(chóng)其他致病型群體中沒(méi)有擴(kuò)增出該條帶，說(shuō)明菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體SCAR標(biāo)記成功建立，并將其命名為SC-S232。

關(guān)鍵詞：小麥；菲利普孢囊線蟲(chóng)；致病型；分子檢測(cè)

禾谷類(lèi)作物孢囊線蟲(chóng)病是世界性的植物寄生線蟲(chóng)病害，起初認(rèn)為只危害溫帶禾谷類(lèi)作物，現(xiàn)已蔓延危害生長(zhǎng)在不同溫度帶、各種土質(zhì)的禾谷類(lèi)作物[1]，成為威脅小麥安全生產(chǎn)的一類(lèi)重要病害。禾谷孢囊線蟲(chóng)組是個(gè)復(fù)合種群，由12個(gè)正式定名的種和幾個(gè)未定名的種組成，其中禾谷孢囊線蟲(chóng)(Heteraderaavenae)、菲利普孢囊線蟲(chóng)(H.filipjevi)和麥類(lèi)孢囊線蟲(chóng)(H.latipons)被認(rèn)為是危害最嚴(yán)重的三個(gè)種，并且有時(shí)這三種線蟲(chóng)會(huì)同時(shí)存在[2-5]。禾谷孢囊線蟲(chóng)病于1874年首次在德國(guó)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已遍布50多個(gè)國(guó)家[6]。我國(guó)于1989年在湖北天門(mén)初次發(fā)現(xiàn)該病[7]，目前已在湖北、河南、陜西、甘肅、江蘇、寧夏、山東、內(nèi)蒙、天津、青海、安徽、新疆、西藏、河北、山西和北京16個(gè)省(市)發(fā)生[8-18]。該線蟲(chóng)病在河南省發(fā)生普遍且嚴(yán)重，除了南陽(yáng)和信陽(yáng)外，其他16個(gè)市小麥均發(fā)生該病，嚴(yán)重危害當(dāng)?shù)匦←溕a(chǎn)。2010年，Peng等[19]和Li等[20]在河南省許昌市首次發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲(chóng)，隨后在該省7個(gè)地市發(fā)現(xiàn)該線蟲(chóng)種。目前，菲利普孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生和分布僅在河南地區(qū)有公開(kāi)報(bào)道，同時(shí)河南省也是燕麥孢囊線蟲(chóng)和菲利普孢囊線蟲(chóng)混合發(fā)生的唯一省份。

小麥孢囊線蟲(chóng)病是一種土傳病害，在中國(guó)發(fā)生面積較廣，給防治帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。郝 瑞等[21]用甘農(nóng)種衣劑Ⅲ號(hào)在小麥種植前對(duì)種子進(jìn)行包衣處理，能有效減少小麥根際周?chē)寥乐泻坦阮?lèi)作物孢囊線蟲(chóng)(Cereal cyst nematode，CCN)的數(shù)量，但是目前高效低毒殺線蟲(chóng)制劑的成本較高，在推廣應(yīng)用的過(guò)程中會(huì)受到一定的限制；Singh等[22]發(fā)現(xiàn)通過(guò)休耕，在CCN沒(méi)有寄主的條件下，燕麥孢囊線蟲(chóng)(H.avenae)自發(fā)孵化造成幼蟲(chóng)死亡，能使其數(shù)量每年降低70%～80%，但在眾多國(guó)家和地區(qū)，因受各種因素的限制，加上土地閑置會(huì)引起難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失，所以這種防治方式并不現(xiàn)實(shí)；張樹(shù)武等[23]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)枝木霉分生孢子懸浮液對(duì)CCN的致死作用較強(qiáng)，對(duì)CCN具有生防潛力，但是現(xiàn)在多數(shù)小麥CCN的生防真菌還沒(méi)研發(fā)成生防制劑，還未在生產(chǎn)上應(yīng)用。當(dāng)前，種植抗病品種被認(rèn)為是防治CCN的有效途徑。要合理利用抗病品種，認(rèn)識(shí)病原線蟲(chóng)的種類(lèi)和致病型就顯得尤為重要。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和依靠鑒別寄主進(jìn)行鑒定，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且難以鑒別和區(qū)分近似種、生理小種間的差異。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別線蟲(chóng)種類(lèi)和致病型成為一種趨勢(shì)。RAPD技術(shù)是由Williams等[24]和Welsh等[25]于1990年發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)，與其他技術(shù)相比，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要知道目的基因序列、所需樣品量少和引物具有普遍性等優(yōu)點(diǎn)，目前已成功應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)屬內(nèi)不同種及種內(nèi)群體的鑒定[26]。Caswell-Chen等[27]運(yùn)用RAPD技術(shù)成功區(qū)分了甜菜孢囊線蟲(chóng)(H.schachtii)和十字花科孢囊線蟲(chóng)(H.cruciferae)。Lopez-Braiia等[28]對(duì)采集自多個(gè)國(guó)家的11個(gè)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體進(jìn)行了RAPD分析，成功將這11個(gè)群體分為H.avenae和Gotland strain兩大種族。鄭經(jīng)武等[29]利用RAPD技術(shù)分析了中國(guó)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上重要的四種植物線蟲(chóng)的遺傳差異，并獲得了燕麥孢囊線蟲(chóng)種的特異性分子標(biāo)記。劉 佳等[30]采用RAPD技術(shù)對(duì)黃淮麥區(qū)的小麥孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行了分析，并獲得了禾谷孢囊線蟲(chóng)滎陽(yáng)致病型群體的RAPD標(biāo)記。SCAR技術(shù)最初是由RAPD技術(shù)發(fā)展而來(lái)，和RAPD標(biāo)記相比較，它的引物更長(zhǎng)并且能夠和模板完全互補(bǔ)，這樣擴(kuò)增結(jié)果更加穩(wěn)定，重復(fù)性更強(qiáng)。Meng等[31]成功地將南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)及爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)特異的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成為SCAR標(biāo)記。Ou等[32]采用RAPD-SCAR標(biāo)記技術(shù)得到了大豆孢囊線蟲(chóng)的特異性SCAR標(biāo)記。Adam等[33]利用SCAR技術(shù)成功區(qū)別開(kāi)了根結(jié)線蟲(chóng)屬的7個(gè)種群。亓?xí)岳虻萚34]開(kāi)發(fā)了禾谷孢囊線蟲(chóng)的RAPD標(biāo)記，并轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，所獲得的SCAR標(biāo)記能夠?qū)坦孺吣揖€蟲(chóng)進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)。

以前的大量研究采用不同的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的不同種進(jìn)行分子鑒定，但是很少有借助分子手段對(duì)種下不同致病型或生理小種進(jìn)行鑒定的報(bào)道。2010年，Peng等[19]和Li等[20]采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法，首次報(bào)道在中國(guó)引起小麥孢囊線蟲(chóng)病的病原線蟲(chóng)除了燕麥孢囊線蟲(chóng)外，還有菲利普孢囊線蟲(chóng)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室近年的研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)黃淮麥區(qū)存在禾谷孢囊線蟲(chóng)和菲利普孢囊線蟲(chóng)多種致病型混合侵染危害小麥的現(xiàn)象[35-39]。傳統(tǒng)的致病型鑒定方法周期太長(zhǎng)，而且結(jié)果易受主客觀因素的影響。鑒于此，本研究擬采用RAPD與SCAR標(biāo)記技術(shù)，以黃淮麥區(qū)已明確致病型的9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體為研究對(duì)象進(jìn)行研究，以期建立一套簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的SCAR標(biāo)記檢測(cè)體系，為小麥孢囊線蟲(chóng)病的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材 料

本研究共收集了9個(gè)地區(qū)土樣，具體地理位置及各個(gè)地理位置所含有的線蟲(chóng)種類(lèi)信息見(jiàn)表1。這9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體可分為5個(gè)致病型，其中，禾谷孢囊線蟲(chóng)包括3個(gè)致病型：(1)河南滎陽(yáng)致病型，(2)河北保定和河南商丘致病型，(3)河南安陽(yáng)、河南清豐和河南杞縣致病型；菲利普孢囊線蟲(chóng)包括2個(gè)致病型：(1)河南許昌致病型，(2)河南淮陽(yáng)和河南博愛(ài)致病型。7月下旬到8月初，從發(fā)病CCN小麥田挖取足量小麥根際周?chē)耐寥?，過(guò)篩(20目在上，60目在下)，將60目上的孢囊和有機(jī)質(zhì)混合物晾掉過(guò)多水分后放到75%蔗糖溶液中充分?jǐn)嚢?，用紗布收集漂浮在蔗糖溶液上面的孢囊，放在清水中反?fù)沖洗，將獲得的孢囊晾干，在體視鏡下用挑針慢慢的挑取孢囊，每個(gè)群體選取40個(gè)左右孢囊，進(jìn)行單孢囊的擴(kuò)繁，備用。

1.2方 法

1.2.1單孢囊DNA的提取

采用蛋白酶K-buffer法[24]提取單孢囊DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度和純度，并稀釋至50 ng·μL-1，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　采集樣品的地理位置及其所含線蟲(chóng)種類(lèi)信息表

1.2.2RAPD標(biāo)記的建立

擴(kuò)增所用的97條RAPD隨機(jī)引物均由上海生工生物工程公司合成，2×TaqPCR Master Mix購(gòu)自萊楓生物工程公司。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，RAPD引物(10 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，36 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在EB中染色，然后用凝膠成像系統(tǒng)Ingenius LHR despodch記錄并分析RAPD譜型。

1.2.3SCAR標(biāo)記的建立

用快速型瓊脂糖DNA回收試劑盒Ⅱ型(BioTeKe公司)對(duì)隨機(jī)引物S232擴(kuò)增的特異性RAPD條帶進(jìn)行切膠、回收純化后，將純化產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa公司)連接，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。經(jīng)培養(yǎng)后，采用菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆委托上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)引物 F232-8-1/R232-8-1(F232-8-1:5′-CCACTCTATAGGATTGCCAT TG-3′; R232-8-1: 5′-CCACTTCCGTAGTTTT CTCA-3′)，對(duì)孢囊線蟲(chóng)的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，R232-8-1(5 μmol·L-1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按1.2.2中所述方法電泳、記錄。

2結(jié)果與分析

2.1RAPD標(biāo)記的建立

1～9分別代表滎陽(yáng)、保定、商丘、安陽(yáng)、清豐、杞縣、許昌、淮陽(yáng)和博愛(ài)小麥孢囊線蟲(chóng)群體；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖2和圖5中同

1～9 indicate cereal cyst nematode populations from Xingyang,Baoding,Shangqiu,Anyang,Qingfeng,Qixian,Xuchang,Huaiyang and Boai,respectively; M:DL2000(TaKaRa company)；Arrow shows specific band.The same as in Fig.2 and Fig.5

圖1隨機(jī)引物S232對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1PCR products of 5 pathotypes amplified from 9 cereal cyst nematode populations

with random primer S232 separated on ethidium bromide-stained 1% agarose gel

利用97條RAPD隨機(jī)引物對(duì)黃淮麥區(qū)5個(gè)致病型共9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每條引物至少重復(fù)擴(kuò)增3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有90條引物在5個(gè)不同致病型中具有多態(tài)性，可擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性好的條帶。其中，2條引物能對(duì)黃淮麥區(qū)5個(gè)致病型共9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。引物S232(5′-ACCC CCCACT-3′)和引物S278(5′-TTCAGGGCAC-3′)擴(kuò)增出了淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體特異性條帶(圖1、圖2)，大小分別為550 bp和1 700 bp。為消除個(gè)體的差異，隨機(jī)挑取淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體各3個(gè)單孢囊純系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果(圖3、圖4)顯示，這2個(gè)引物均能擴(kuò)增出相同的淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體特異性條帶，和前述PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，說(shuō)明這兩個(gè)RAPD標(biāo)記確實(shí)是淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體的特異性分子標(biāo)記。

2.2SCAR標(biāo)記的建立

將隨機(jī)引物S232擴(kuò)增的特異性RAPD條帶進(jìn)行回收，克隆后送菌液到上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，引物S232擴(kuò)增出的淮陽(yáng)和博愛(ài)群體的特異性條帶大小為517 bp，Blast比對(duì)，序列覆蓋率(Query coverage)在4%～14%之間，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何同源序列。

依據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物F232-8-1/R232-8-1，對(duì)線蟲(chóng)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，引物F232-8-1/R232-8-1可以從淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體中擴(kuò)增出大小為517 bp的條帶(圖5)，而黃淮麥區(qū)其他致病型群體中沒(méi)有擴(kuò)增出此特異性條帶。說(shuō)明該引物是菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體的特異性引物，即菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體特異性SCAR標(biāo)記成功建立，并將其命名為SC-S232。

圖2　隨機(jī)引物S278對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體的擴(kuò)增結(jié)果

1～3: 淮陽(yáng)小麥單孢囊線蟲(chóng)；4～6：博愛(ài)小麥單孢囊線蟲(chóng)；M：DL2000(TaKaRa公司)；箭頭所示為特異性條帶。圖4中同

1～3 indicate 3 cysts from pure lines of Huaiyang population; 4～6 indicate 3 cysts from pure lines of Boai population; M: DL2000(TaKaRa company);Arrow shows specific band.The same as in Fig. 4

圖3隨機(jī)引物S232對(duì)隨機(jī)挑取的淮陽(yáng)和博愛(ài)小麥孢囊線蟲(chóng)群體各3個(gè)單孢囊純系的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3PCR products of single-cyst DNA amplified with random primer S232 from the respective

three samples collected from Huaiyang,and Boai in Henan Province

圖4　隨機(jī)引物S278對(duì)隨機(jī)挑取的淮陽(yáng)和博愛(ài)小麥孢囊線蟲(chóng)群體各3個(gè)單孢囊純系的擴(kuò)增結(jié)果

3討 論

目前在我國(guó)小麥禾谷孢囊病引起的小麥危害面積已達(dá)333萬(wàn)hm2以上，嚴(yán)重地塊損失率可高達(dá)70%以上，已經(jīng)成為我國(guó)小麥生產(chǎn)中的一個(gè)重要問(wèn)題[40]。本研究選取的線蟲(chóng)群體基本上覆蓋了黃淮麥區(qū)重要的小麥孢囊線蟲(chóng)發(fā)生地區(qū)，建立孢囊DNA的分子檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，可大大縮短鑒定時(shí)間，而且使鑒定結(jié)果更加可靠，簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，有助于提高檢測(cè)效率。

10：陰性對(duì)照Negative control

圖5引物F232-8-1/R232-8-1對(duì)5個(gè)致病型9個(gè)小麥孢囊線蟲(chóng)群體的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.5PCR products of 5 pathotype amplified from 9 cereal cyst nematode

populations with specific marker F232-8-1/R232-8-1

RAPD技術(shù)具有豐富的多態(tài)性和易操作性，因此它適合于檢測(cè)種及其以下水平的多樣性，但是，RAPD技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性差，需要進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行RAPD反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化，為了便于在實(shí)際運(yùn)用中推廣，本研究將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。本研究中獲得了2個(gè)菲利普孢囊線蟲(chóng)淮陽(yáng)和博愛(ài)致病型群體相關(guān)的RAPD標(biāo)記，但只有S232擴(kuò)增出的RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，而S278擴(kuò)增出的RAPD標(biāo)記沒(méi)有轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，分析SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化失敗的原因可能跑電泳樣品間污染造成。實(shí)驗(yàn)中利用DNAMAN軟件對(duì)S278特異性條帶序列設(shè)計(jì)了5對(duì)SCAR標(biāo)記引物，但依然沒(méi)有特異性，推測(cè)特異性條帶表現(xiàn)的不是其在致病型間的差異。

菲利普孢囊線蟲(chóng)種的分子鑒定，已有很多研究報(bào)道，多是采用不同的限制性?xún)?nèi)切酶酶切線蟲(chóng)的rDNA-ITS序列，來(lái)區(qū)分不同的線蟲(chóng)種類(lèi)[41-46]。Peng等[47]開(kāi)發(fā)了菲利普孢囊線蟲(chóng)種特異性的SCAR標(biāo)記，并對(duì)所找到的SCAR標(biāo)記的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)所找到的SCAR標(biāo)記對(duì)2齡幼蟲(chóng)裂解物的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.125 μL，對(duì)雌成蟲(chóng)裂解物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3.9×10-3μL。Toumi等[48]根據(jù)菲利普孢囊線蟲(chóng)的COI基因設(shè)計(jì)引物從Heterodera屬的混合群體中特異性的檢測(cè)出菲利普孢囊線蟲(chóng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5條線蟲(chóng)。但是已有的研究報(bào)道多是針對(duì)植物寄生線蟲(chóng)不同種的分子檢測(cè)和鑒定，很少有將研究目標(biāo)對(duì)準(zhǔn)種下生理小種或致病型的分子檢測(cè)和鑒定。本實(shí)驗(yàn)室將通過(guò)擴(kuò)大引物的篩選范圍，來(lái)獲得更多的致病型相關(guān)的分子標(biāo)記，并通過(guò)收集更多的菲利普孢囊線蟲(chóng)和禾谷孢囊線蟲(chóng)致病型群體來(lái)檢測(cè)所獲得標(biāo)記的特異性和有效性；另一方面還需要拓寬思路為致病型的分子檢測(cè)探索出更簡(jiǎn)便快捷的技術(shù)和方法，將小麥孢囊線蟲(chóng)的致病型分子檢測(cè)體系和傳統(tǒng)的致病型鑒定方法相結(jié)合，建立一套完整的小麥孢囊線蟲(chóng)致病型檢測(cè)體系，為抗病品種的選育和合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Riley I T,Nicol J M,Dababat A A.Cereal cyst nematodes:status,research and outlook [C]//Proceedings of the First Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,2009:21-23.

[2]Yan G P,Smiley R W.DistinguishingHeteroderafilipjeviandH.avenaeusing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism and cyst morphology [J].Phytopathology,2009,100:216-224.

[3]Abidou H,El-Ahmed A,Nicol J M,etal.Occurrence and distribution of species of theHeteroderaavenaegroup in Syria and Turkey [J].NematologiaMediterranea,2005,33:195-201.

[4]Toumi F,Hassan G,Waeyenberge L,etal.Distribution of cereal cyst nematodes(Heteroderaspp.) in wheat and barley fields in northeastern regions of Syria [C]//Proceedings of the Third Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Adana,Turkey,2012:310.

[5]Rivoal R,Nicol J M.Past research on the cereal cyst nematode complex and future needs [C]//Cereal Cyst Nematodes:Status,Research and Outlook,Ankara,Turkey,2009:3-10.

[6]Maafi Z T,Nicol J M,Kazemi H.Cereal cyst nematodes,root rot pathogens and root lesion nematodes affecting cereal production in Iran [C]//Cereal Cyst Nematodes:Status,Research and Outlook,Ankara,Turkey,2009:51-55.

[7]陳品三,王明祖,彭德良.我國(guó)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)的發(fā)現(xiàn)與鑒定初報(bào) [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),1991,24(5):89-91.

Chen P S,Wang M Z,Peng D L.Preliminary report of identification on cereal cyst nematode of wheat in China [J].ScientiaAgriculturaSinica,1991,24(5):89-91.

[8]王振躍,王守正,李洪連,等.河南省小麥孢囊線蟲(chóng)病的初步研究 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1993,8(s):105-109.

Wang Z Y,Wang S Z,Li H L,etal.A preliminary study on wheat cyst nematode diseasa in Henan province [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,1993,8(s):105-109.

[9]趙 杰,鈕緖燕,張管曲,等.陜西省中南部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生與分布 [J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,20(6):181-185.

Zhao J,Niu X Y,Zhang G Q,etal.Occurrence and distribution of cereal cyst nematode in central-south Shaanxi province [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidenalisSinica,2011,20(6):181-185.

[10]葉文興,徐炳良,彭德良,等.甘肅省小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列特征及ITS-RFLP分析 [J].植物保護(hù),2010,36(3):58-65.

Ye W X,Xu B L,Peng D L,etal.Sequence and RFLP analysis of rDNA-ITS and 28S rDNA-D2/D3 regions ofHeteroderaavenaeon wheat from Gansu province in China [J].PlantProtection,2010,36(3):58-65.

[11]王 暄,梁中偉,裴世安,等.江蘇省小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)群體核糖體rDNA-ITS區(qū)序列分析 [J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(6):55-62.

Wang X,Liang Z W,Pei S A,etal.Sequences analysis of rDNA-ITS region of cereal cyst nematodes on wheat from Jiangsu province [J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2010,33(6):55-62.

[12]黃文坤,葉文興,王高峰,等.寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生與分布 [J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(1):74-77.

Huang W K,Ye W X,Wang G F,etal.Occurrence and distribution ofHeteroderaavenaeWollenweber in Ningxia Hui Autonomous Region [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,2011,30(1):74-77.

[13]楊遠(yuǎn)永,趙洪海,彭德良.小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)在山東省的分布報(bào)道 [J].青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,27(1):17-20.

Yang Y Y,Zhao H H,Peng D L.New distribution report of cereal cyst nematode on wheat in Shandong province [J].JournalofQingdaoAgriculturalUniversity:NaturalScience,2010,27(1):17-20.

[14]陳 新,周洪友,馬 璽.內(nèi)蒙古中西部地區(qū)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生分布 [J].植物保護(hù),2009,35(5):114-117.

Chen X,Zhou H Y,Ma X.Distribution ofHeteroderaavenaein the middle and west regions of Inner Mongolia,China [J].PlantProtection,2009,35(5):114-117.

[15]彭德良,黃文坤,孫建華,等.我國(guó)天津發(fā)現(xiàn)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng) [M]//中國(guó)線蟲(chóng)學(xué)研究(第四卷).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2012:162-163.

Peng D L,Huang W K,Sun J H,etal.First Report of Cereal Cyst Nematode(Heteroderaavenae)in Tianjin,China [M]//Nematology Research in China(Vol.4).Beijing:China Agriculture Scientech Press,2012:162-163.

[16]候生英,彭德良,王愛(ài)玲,等.青海省小麥孢囊線蟲(chóng)病調(diào)查初報(bào) [J].青海大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,26(5):84-86.

Hou S Y,Pen D L,Wang A L,etal.Preliminary report of investigation on cereal cyst nematode of wheat in Qinghai Province [J].JournalofQinghaiUniversity:NatureScience,2008,26(5):84-86.

[17]楊傳廣,吳慧平,檀根甲,等.安徽省小麥孢囊線蟲(chóng)田間分布及危害調(diào)查 [J].植物保護(hù),2008,34(2):107-110.

Yang C G,Wu H P,Tan G J,etal.Investigations on the distribution of and damages caused by cereal cyst nematode in Anhui [J].PlantProtection,2008,34(2):107-110.

[18]李惠霞,柳永娥,魏 莊,等.新疆和西藏發(fā)現(xiàn)禾谷孢囊線蟲(chóng) [M]//中國(guó)線蟲(chóng)學(xué)研究(第四卷).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2012:164-165.

Li H X,Liu Y E,Wei Z,etal.The Detection ofHeteroderaavenaefrom the Cereal Field in Autonomous Regions of Tibet and Xinjiang [M]//Nematology Research in China(Vol.4).Beijing:China Agriculture Scientech Press,2012:164-165.

[19]Peng D,Ye W,Peng H,etal.First report of the cyst nematode(Heteroderafilipjevi) on wheat in Henan province,China [J].PlantDisease,2010,94(10):1262.

[20]Li H,Yuan H,Sun J,etal.First record of the cereal cyst nematodeHeteroderafilipjeviin China [J].PlantDisease,2010,94(12):1505.

[21]郝 瑞,黃文坤,劉崇俊,等.新型種衣劑防治小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病研究 [J].植物保護(hù),2014,40(1):182-186.

Hao R,Huang W K,Liu C J,etal.Effect of seed-coatings on controlling cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) of wheat [J].PlantProtection,2014,40(1):182-186.

[22]Singh A,Sharma A,Shoran J,etal.Heteroderaavenaeand its management on wheat in India [C]//Proceedings of the First Workshop of the International Cereal Cyst Nematode Initiative,Antalya,Turkey,2009:21-23.

[23]張樹(shù)武,徐秉良,薛應(yīng)鈺,等.長(zhǎng)枝木霉對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)的致死作用 [J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2014,25(7):2093-2098.

Zhang S W,Xu B L,Xie H Y,etal.Lethal effects ofTrichodermalongibrachiatumonHeteroderaavenae[J].ChineseJournalofAppliedEcology,2014,25(7):2093-2098.

[24]Williams J G K,Kubelik A R,Livak K J,etal.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic marker [J].NucleicAcidsResearch,1990,8:6531-6535.

[25]Welsh J,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J].NucleicAcidsResearch，1990,18:7213-7218.

[26]Hashmi G,Glazer I,Gaugler R I.Molecular comparisons of entomopathoganic nematodes using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) makers [J].FundamentalandAppliedNematology,1996,19(4):399-406.

[27]Caswell-Chen E P,Williamson V M,Wu F F,etal.Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeteroderacruciferaeandH.schachtiipopulations [J].JournalofNematology,1992,24(3):343-351.

[28]Lopez-Braiia I,Romero M D,Delibes A.Analysis ofHeteroderaavenaepopulations by the random amplified polymorphic DNA technique [J].Genome,1996,39(1):118-122.

[29]鄭經(jīng)武,許建平,陳衛(wèi)良,等.四種植物線蟲(chóng)的RAPD比較及鑒定研究 [J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1998,6(2):108-116.

Zheng J W,Xu J P,Chen W L,etal.Molecular comparison and identification of four plant nematodes using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) markers [J].JournalofAdriculturalBiotechnology,1998,6(2):108-116.

[30]劉 佳,徐 嬌,代君麗,等.中國(guó)黃淮麥區(qū)燕麥孢囊線蟲(chóng)滎陽(yáng)群體致病型相關(guān)RAPD標(biāo)記的建立 [J].麥類(lèi)作物學(xué)報(bào),2013,33(6):1294-1299.

Liu J,Xu J,Dai J L,etal.RAPD markers ofHeteroderaavenaeXingyang population from Huang-huai Floodplain in China [J].JournalofTriticeaeCrops,2013,33(6):1294-1299.

[31]Meng Q P,Long H,Xu J H.PCR assays for rapid and sensitive identification of three major root-knot nematodes,Meloidogyneincognita,M.javanicaandM.arenaria[J].ActaPhytopathologicaSinica,2004,34(3):204-210.

[32]Ou S Q,Peng D L,Liu X M,etal.Identification ofHeteroderaglycinesusing PCR with sequence characterised amplified region(SCAR) primers [J].Nematology,2008,10(3):397-403.

[33]Adam M A M,Phillips M S,Blok V C.Molecular diagnostic key for identification of single juveniles of seven common and economically important species of root-knot nematode(Meloidogynespp.) [J].PlantPathology,2007,56:190-197.

[34]亓?xí)岳?彭德良,彭 煥,等.基于SCAR 標(biāo)記的小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)快速分子檢測(cè)技術(shù) [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(21):4388-4395.

Qi X L,Peng D L,Peng H,etal.Rapid molecular diagnosis based on SCAR marker system for cereal cyst nematode [J].ScientiaAgriculturaSinica,2012,45(21):4388-4395.

[35]楊衛(wèi)星.河南省小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)致病型及發(fā)生規(guī)律研究 [D].洛陽(yáng):河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

Yang W X.Pathotype and occurrence of cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2008.

[36]孫君偉.黃淮麥區(qū)四個(gè)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體種類(lèi)和致病型鑒定及主推品種的抗性評(píng)價(jià) [D].洛陽(yáng):河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

Sun J W.Identification of species and pathotypes from four cereal cyst nematode populitions in Huanghuai wheat plant area and evaluation of main wheat cultivars resistance to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2010.

[37]侯興松.豫西豫北及豫南地區(qū)4個(gè)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體種類(lèi)和致病型鑒定及品種抗性研究 [D].洛陽(yáng):河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Hou X S.Identification on the species and pathotypes of four cereal cyst nematode populationa from western and northern Henan,southern Hebei and evaluation of wheat cultivars resistance to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2011.

[38]年高磊.魯豫皖交界地區(qū)四個(gè)CCN群體種類(lèi)和致病型鑒定及品種對(duì)淮陽(yáng)群體的抗性評(píng)價(jià) [D].洛陽(yáng):河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Nian G L.Identification of species and pathotypes of four cereal cyst nematode populations from Shandong,Henan and Anhui contiguous areas and resistance evaluation of wheat cultivars to Huaiyang populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2011.

[39]張 鵬.河南中部地區(qū)三個(gè)CCN群體種類(lèi)和致病型鑒定及抗性品種篩選 [D].洛陽(yáng):河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

Zhang P.Identification on the species and pathotypes of three cereal cyst nematode populations from the middle area of Henan province and screening of resistant cultivars to two populations [D].Luoyang:Henan Agricultural University,2012.

[40]李洪連.小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病 [M]//植物線蟲(chóng)學(xué).北京：科學(xué)出版社,2011:155-162.

Li H L.Wheat Cyst Nematode Disease [M]//Plant Nematology.Beijing:Science Press,2011:155-162.

[41]Peng D,Nicol J M,Li H,etal.Current knowledge of cereal cyst nematode(Heteroderaavenae) on wheat in China [C]//Cereal Cyst Nematode:Status,Research and Outlook.Ankara,Turkey,2009:29-34.

[42]Bekal S,Gauthier J P,Rivoal R.Genetic diversity among a complex of cereal cyst nematode inferred from RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer region [J].Genome,1997,40:479-486.

[43]Abidou H,Valette S,Gauthier J P,etal.Molecular polymorphism and morphometrics of species of theHeteroderaavenaegroup in Syria and Turkey [J].JournalofNematology,2005,37(2):146-154.

[44]Yan G P,Smiley R W.DistinguishingHeteroderafilipjeviandH.avenaeusing polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism and cyst morphology [J].Phytopathology,2009,100:216-224.

[45]彭德良,葉文興,顧曉川,等.我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)菲利普孢囊線蟲(chóng)(Heteroderafilipjevi)危害小麥 [M]//中國(guó)線蟲(chóng)學(xué)研究.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2013:162-163.

Peng D L,Ye W X,Gu X C,etal.First Report ofHeteroderafilipjevion Wheat in China [M]//Nematology Research in China.Beijing:China Agriculture Scientech Press,2010:162-163.

[46]Yan G P,Smiley R W,Okubara P A,etal.Species-specific PCR assays for differentiatingHeteroderafilipjeviandH.avenae[J].PlantDisease,2013,97(12):1611-1619.

[47]Peng H,Qi X L,Peng D L,etal.Sensitive and direct detection ofHeteroderafilipjeviin soil and wheat roots by species-specific SCAR-PCR assays [J].PlantDisease,2013,97(10):1288-1294.

[48]Toumi F,Waeyenberge L,Viaene N,etal.Development of two species-specific primer sets to detect the cereal cyst nematodesHeteroderaavenaeandHeteroderafilipjevi[J].EuropeanJournalofPlantPathologyl,2013,136:613-624.

Development of SCAR Marker for DetectingHeteroderafilipjeviof Huaiyang and Boai Pathotype Populations from Wheat-growing Regions of the Huang-Huai-Hai Plain in China

XU Jiao,LIU Jia,DAI Junli,LI Honglian

(College of Plant Protection,Henan Agricultural University/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops,Zhengzhou,Henan 450002,China)

Abstract:Heterodera filipjevi was discovered in the Huang-Huai-Hai Plain in China and is a new pathogenic nematode of wheat. It seriously threatens wheat production due to the capability of high pathogenicity. Identification of pathogenic pathotype is quite important for screening and breeding of disease-resistant wheat cultivars.In order to establish a kind of rapid,convenient,and accurate method based on SCAR markers,random amplified polymorphism DNA(RAPD) techniques was used to analyze five pathotypes,including nine cereal cyst nematode(CCN) populations. A total of 97 random primers were screened and 2 of them,S232 and S278,produced distinct bands that were specific for Huaiyang and Boai populations of H.filipjevi based on RAPD method. The two specific bands were 550 base pair(bp),and 1 700 bp in size,respectively. Subsequently,a SCAR marker SC-S232 was developed according to the RAPD marker S232. The results showed that SC-S232 marker amplifies a positive band with a size of 517 bp from the Huangyang and Boai pathotype populations of H.filipjevi,but none product from other pathotype populations of CCN in the Huang-Huai-Hai plain. This SCAR marker SC-S232 can be used to detect the Huangyang and Boai pathotype populations in this region.

Key words:Wheat; Heterodera filipjevi; Pathotype; Molecular detection

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1；S435

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)04-0523-08

通訊作者：代君麗(E-mail: daijl666@sina.com); 李洪連(E-mail: honglianli@sina.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101419)；國(guó)家公益性(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(200903040-4)

收稿日期：2015-11-08修回日期：2015-12-24

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1534.038.html

第一作者E-mail：1789985160@qq.com