張立國,班巧英*,李建政(.山西大學環(huán)境與資源學院,山西 太原 030006；.哈爾濱工業(yè)大學市政與環(huán)境工程學院,黑龍江 哈爾濱 50090)

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UASB反應器中產甲烷菌對溫度脅迫的響應

張立國1,班巧英1*,李建政2(1.山西大學環(huán)境與資源學院,山西 太原 030006；2.哈爾濱工業(yè)大學市政與環(huán)境工程學院,黑龍江 哈爾濱 150090)

摘要：采用間歇培養(yǎng)方式探討了升流式厭氧污泥床(UASB)反應器中不同營養(yǎng)類型產甲烷菌對溫度脅迫的響應規(guī)律.研究結果表明,產甲烷螺旋菌(Methanospirillum)是該反應器的主要氫營養(yǎng)型產甲烷菌,而主要乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌為產甲烷絲狀菌(Methanosaeta).在35℃條件下,氫營養(yǎng)型和乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌的累計甲烷產量分別為24.7, 11.7mL,而最大產甲烷速率分別為0.74, 0.18mL/h.當溫度從35℃分別降低至30, 25, 20, 15℃時,導致氫營養(yǎng)型產甲烷菌的累計產甲烷量分別減少了14.2%, 34.0%, 47.0%, 57.5%,而乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌的累計產甲烷量分別減少了5.1%, 23.9%, 45.3%, 95.7%.由此可見,在20～30℃時氫營養(yǎng)型產甲烷菌對溫度脅迫更加敏感,而在15℃以下時乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產甲烷菌對溫度脅迫更加敏感.

關鍵詞：UASB反應器；產甲烷菌；溫度脅迫；產甲烷量

* 責任作者, 講師, banqiaoying@163.com

有機物厭氧生物處理是在一系列微生物的協(xié)同代謝作用下完成的,包括水解發(fā)酵菌群,產氫產乙酸菌,同型產乙酸菌和產甲烷菌[1-3].其中,產甲烷菌位于食物鏈的最末端,在產甲烷系統(tǒng)中占有獨特的生態(tài)位[4].由于產甲烷菌只能利用H2/CO2,乙酸,甲酸,甲胺等簡單的底物進行生長代謝,且增殖緩慢,對環(huán)境因子變化亦較敏感,因此通常被認為是厭氧生物處理過程的限速步驟[5-6].溫度是厭氧微生物重要生態(tài)因子之一,它不僅能夠影響微生物的生長速率,同時可能會改變微生物的活性、豐富度等[7-8].另外,溫度變化可能會引起系統(tǒng)pH值下降和游離氨濃度的增加,進而影響水解,產酸發(fā)酵和產甲烷效率,最終影響到厭氧生物處理反應器效能及其穩(wěn)定性[9-10].

目前,關于溫度變化對厭氧反應器中不同營養(yǎng)型產甲烷菌活性影響的報道較少,本研究考察了產甲烷菌群對溫度脅迫的響應規(guī)律,為厭氧生物處理反應器運行調控提供參考.

1　材料與方法

1.1 接種污泥

接種污泥取自本實驗室正在運行的升流式厭氧污泥床反應器(UASB),該反應器長期處理丙酸合成廢水(以丙酸為唯一碳源).UASB的運行情況,溫度35℃,水力停留時間(HRT)10h,進水COD 3000mg/L,比COD去除率和比甲烷生成率分別為1.4kgCOD/(kgVSS·d)和285.3LCH4/ (kgCODremoved· d).

1.2 靜態(tài)搖瓶試驗

靜態(tài)搖瓶試驗采用間歇培養(yǎng)方式進行,實驗容器為150mL血清瓶.每個血清瓶中加入10mLUASB反應器中的厭氧顆粒污泥(MLVSS為2.4g/L)和40mL液體培養(yǎng)基,其中碳源分別為H2/CO2(150mL,體積比4:1)或乙酸(500mg/L).將培養(yǎng)液pH值用1mol/L HCl 或1mol/L NaOH調至7.0.然后將血清瓶分別置于5個恒溫空氣浴搖床(15,20,25,30,35℃)進行靜態(tài)搖甁試驗.每個溫度梯度做3個平行樣,數(shù)據(jù)分析取其平均值.每12h測定一次產氣量,氣體組成,每24h測定一次揮發(fā)酸組成.

1.3 DNA提取和qPCR分析

取0.15g污泥樣品用磷酸緩沖液沖洗若干次進行DNA提取.基因組DNA提取采用DNA提取試劑盒(MO Bio Laboratories,Inc.,Carlsbad,CA, USA).以前的研究發(fā)現(xiàn),該UASB反應器中的產甲烷菌主要來自產甲烷絲狀菌屬(Methanosaeta)和產甲烷螺旋菌屬(Methanospirillum)[11].因此,對這兩個屬的產甲烷菌進行定量分析.所用引物分別為,Methanosaeta,5′-GCATCGAGATTTAAAG CTC-3′,5′-AGCCAGATTTGTAACCTGGC-3′;M ethanospirillum,5′-AACGGCCCAACAAGCCT GTC-3′,5′-GGACTTGTATATCCAGCA CG-3′.

本實驗中的定量分析采用絕對定量方式.標準樣品為含目的基因序列的重組pMD18-T質粒.將標準樣品進行10倍梯度稀釋(101～107).標準樣品和待測樣品同時進行實時熒光定量PCR檢測(qPCR).qPCR在熒光定量分析系統(tǒng)(Model 7500,ABI,Foster,CA,USA)中完成,所用熒光染料為SYBR green.反應體系:引物1μmol/L,SYBR Green Mix 10μL(Toyobo Co.,LTD.,Japan),H2O 5.96μL,ROX 0.04μL,DNA模板3μL.反應程序:94℃預變性1min,94℃ 15s,58℃ 30s,72℃ 35s數(shù)據(jù)采集,40個循環(huán).每個qPCR反應設置3個重復.以達到對數(shù)增長時的循環(huán)數(shù)(Ct值)為橫坐標,標準質粒數(shù)目的對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線,得到關于Methanospirillum和Methanosaeta的一元線性回歸方程分別為y=-0.3051x+11.626 (R2= 0.9929),y=-0.2669x+10.455 (R2=0.9982).

1.4 分析項目及方法

生物量(揮發(fā)性懸浮固體總量MLVSS)采用標準方法測定[12],甲烷發(fā)酵產氣量通過10～50mL的玻璃注射器排氣計量.發(fā)酵氣體的組分和揮發(fā)酸濃度分別采用山東魯南瑞虹化工儀器有限公司的SP-6800A型(TCD檢測器)和SP-6890型(FID檢測器)氣相色譜測定.累計甲烷產量參照Owen法進行計算[13].

1.5 動力學分析

不同溫度下的產甲烷動力學分析參照Gompertz模型.公式如式(1):

其中:M為反應t(h)累計甲烷產量,mL;Pmax為最大產甲烷量,mL;Rmax為最大產甲烷速率,mL/h;,λ為延遲時間,h.將累計甲烷產量和相應反應時間代入公式,用統(tǒng)計軟件Origin 8.0計算出Pmax、Rmax、λ[14].

2　結果與討論

2.1 產甲烷菌的定量分析

在進水COD 3000mg/L和35℃條件下, UASB 的COD去除率為95%,比產甲烷速率為0.26L/g CODremoved,說明一些較高活性的產甲烷菌存在于該系統(tǒng)中.基于16S rRNA基因序列的PCR-DGGE分析表明,產甲烷絲狀菌屬(Methanosaeta)為該系統(tǒng)中優(yōu)勢乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌,而優(yōu)勢氫營養(yǎng)型產甲烷菌為產甲烷螺旋菌屬(Methanospirillum)[11].產甲烷絲狀菌只能利用乙酸作為底物,而產甲烷螺旋菌只能利用H2/CO2作為底物[15-16].為了考察UASB中這兩類產甲烷菌的數(shù)量,對它們進行了qPCR分析.結果表明,Methanosaeta的數(shù)量為2.7×10516SrRNA基因拷貝數(shù)/ngDNA.Methanospirillum的數(shù)量比Methanosaeta少了2個數(shù)量級,只有1.8×10316S rRNA基因拷貝數(shù)/ng DNA.已有研究結果表明,在乙酸含量較低的生物反應器中Methanosaeta為優(yōu)勢乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌,而且Methanosaeta在顆粒污泥中的含量要高于絮狀污泥[17-18].這可能是由于產甲烷絲狀菌特殊的形態(tài)有利于顆粒污泥形成的原因.

2.2 甲烷生成對溫度脅迫的響應規(guī)律

定量分析的結果表明,氫營養(yǎng)型產甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌分別來自產甲烷螺旋菌屬和產甲烷絲狀菌屬.H2/CO2和乙酸不僅是產甲烷菌可利用的主要底物,而且是有機物厭氧生物處理過程中重要的中間代謝產物.為了了解溫度對不同營養(yǎng)類型產甲烷菌活性的影響,本研究分別以H2/CO2和乙酸作為底物考察溫度降低對氫營養(yǎng)型產甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌活性的影響.圖1表明,在35℃條件下,接種培養(yǎng)60h后累計產甲烷量就達到了最大值24.7mL.當溫度從35℃分別降低至30℃和25℃時,甲烷生成速率降低,最終累計產甲烷量比對照(35℃)減少了14.2%和34.0%(表1).

當溫度分別降低至20℃和15℃時(圖1),甲烷的生成出現(xiàn)了明顯的停滯期,該停滯期約為24～28h,表明低溫對氫營養(yǎng)型產甲烷菌代謝活性造成了顯著抑制作用.經過24～28h的停滯期后,累積產甲烷量開始逐漸增加,表明氫營養(yǎng)型產甲烷菌經過24h的適應,其代謝活性緩慢恢復.累計產甲烷量最后分別穩(wěn)定在13.1,10.5mL左右.值得注意的是,20和15℃時的累積產甲烷趨勢與35,30,25℃時的累積產甲烷趨勢明顯不同.20℃和15℃時出現(xiàn)了明顯的停滯期,更重要的是累積產甲烷量呈線性增加趨勢,而35,30,25℃時的累積產甲烷量呈現(xiàn)的是先線性增加,后緩慢增加(平臺期)的趨勢.這2種累積產甲烷趨勢的不同,意味著在20℃和15℃繼續(xù)延長培養(yǎng)時間,產甲烷量會持續(xù)增加,而在35,30,25℃條件下產甲烷量則不會持續(xù)增加.由此可以看出,低溫對氫營養(yǎng)型產甲烷菌的脅迫是通過控制半速度常數(shù)Ks來實現(xiàn)的.隨著溫度的下降,Ks迅速增加,使得氫營養(yǎng)型產甲烷菌對H2/CO2轉化速率顯著下降,最終導致甲烷產量的下降.

圖1　不同溫度條件下氫營養(yǎng)型產甲烷菌甲烷產量Fig.1　CH4 production of hydrogenotrophic methanogens at different temperature conditions

表1　不同溫度條件下的產甲烷特征Table 1　Methanogenic characteristics at different temperature conditions

如圖2所示,當以乙酸為底物時,產甲烷菌在35℃條件下表現(xiàn)出良好的活性,在接種培養(yǎng)84h后累計產甲烷量達到最大值11.7mL.溫度從35℃降低至30,25,20,15℃導致產甲烷速率顯著降低.在30,25,20℃,15℃條件下的累計產甲烷量比對照(35 ℃)分別減少了5.1%,23.9%,45.3%,95.7%(表1).

圖2　不同溫度條件下乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌甲烷產量Fig.2　CH4 production of acetotrophic methanogens at different temperature conditions

當溫度降低至15℃時(圖2),甲烷的生成出現(xiàn)了明顯的停滯期,并且該停滯期長達96h,表明低溫對乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌代謝活性造成了嚴重的抑制作用.盡管經過了96h的停滯期,累積產甲烷量有所增加,但甲烷產量與35℃時相比,減少了95.7%.可見,低溫(15℃)對乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌代謝活性造成了長期的抑制作用.與氫營養(yǎng)型產甲烷菌累積產甲烷趨勢相似,乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌在35,30,25,20℃時的累積產甲烷量也是先線性增加,后緩慢增加(平臺期),而在15℃時出現(xiàn)了96h的停滯期,且隨后累積產甲烷量呈線性增加趨勢.由此可見,低溫對乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌的脅迫也是通過控制半速度常數(shù)Ks來實現(xiàn)的,溫度的下降導致Ks迅速增加,使得乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌利用乙酸的速率顯著下降,導致甲烷產量的迅速下降.盡管在15℃條件下,乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌的活性一直比較低,但如果延長培養(yǎng)時間,乙酸營養(yǎng)型產甲烷細菌可能適應低溫環(huán)境后仍會表現(xiàn)出一定的產甲烷性能.在以前的研究中,也證實了這一點[11].

結合圖1和圖2可以看出,溫度降低對2種營養(yǎng)類型的產甲烷菌的代謝活性都產生了抑制作用,這是因為任何自發(fā)反應總是朝著吉布斯自由能減小的方向進行,而吉布斯自由能是溫度的狀態(tài)函數(shù),溫度下降會使吉布斯自由能增加,進而導致反應速率的下降.從不同溫度條件下累積產甲烷趨勢上可以進一步看出,低溫對兩類產甲烷菌的脅迫是通過控制半速度常數(shù)Ks來實現(xiàn)的,溫度的下降導致Ks迅速增加,使得兩類產甲烷菌代謝速率顯著下降,導致甲烷產量的迅速下降. Lawrence等[18]研究發(fā)現(xiàn),當溫度從35℃降至20 ℃,乙酸鹽轉化為甲烷的Ks值從164mg/L增加到了2130mg/L,與本研究的結果一致.

另外,本研究還發(fā)現(xiàn)溫度降低對不同營養(yǎng)類型產甲烷菌代謝活性的抑制程度存在差異.在20～30℃時乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產甲烷菌表現(xiàn)出更好的耐受性,而在15℃以下時氫營養(yǎng)型產甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性,這可能與溫度降低對2種營養(yǎng)類型的半速度常數(shù)Ks影響程度不同.在20～30℃時,溫度降低對乙酸產甲烷Ks的影響程度弱于H2/CO2產甲烷Ks,而在15℃以下時氫營養(yǎng)型產甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性.換言之,乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產甲烷菌在低溫條件下微生物活性喪失更快.

2.3 動力學分析

如表2所示,擬合系數(shù)(R2)均大于0.98,表明該模型用來描述累計產甲烷量的進程是合理的. 在35℃條件下,氫營養(yǎng)型產甲烷菌的最大產甲烷速率(Rmax)為0.74mL/h,而最大甲烷產量(Pmax)為24.5mL.溫度從35℃分別降至30,25,20,15℃,導致Rmax和Pmax分別減少了58.1%～63.3%和29.5%～58.9%.當溫度≥30℃,甲烷生成沒有被延遲,但是溫度≤25℃時,甲烷生成推遲了1.7～28.7h.對于乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌而言,當溫度從35℃降低至30,25,20,15℃時,Pmax和Rmax減少2.5%～65.8%和13.5%～92.6%.與對照(35℃)相比,溫度下降導致λ增加了0.4～7.4倍.

甲烷生成動力學的結果表明,氫營養(yǎng)型產甲烷菌對溫度下降具有更好的適應性.因此,在相同溫度條件下,氫營養(yǎng)型產甲烷菌的甲烷生成速率高于乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌.盡管在15℃條件下,2類產甲烷菌的甲烷生成速率都比較低,但乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌表現(xiàn)出了更長的遲滯期.該結果很好解釋了在15～20℃時UASB反應器中氫分壓不會增加而乙酸出現(xiàn)短時間積累的原因,這與H?j等[19]前期研究結果一致.

表3　不同溫度條件下產甲烷動力學分析Table 3　Kinetic parameters of methane production under different temperatures

3　結論

3.1 溫度下降可導致氫營養(yǎng)型產甲烷菌和乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌活性受到抑制,并且溫度降低對不同營養(yǎng)類型產甲烷菌活性的抑制程度存在顯著差別.在20～30℃時乙酸營養(yǎng)營養(yǎng)型產甲烷菌對溫度脅迫表現(xiàn)出更好的耐受性,而在15℃以下時氫營養(yǎng)型產甲烷菌則表現(xiàn)出更好的耐受性.

3.2 溫度降低使兩類產甲烷菌的Pmax和λ發(fā)生了顯著變化.氫營養(yǎng)型產甲烷菌的Pmax由35℃時的24.5mL逐漸降低至15℃時的11.7mL,λ被延長了1.7～28.7h.而乙酸營養(yǎng)型產甲烷菌Pmax比35

℃條件下減少了2.5%～92.6%,λ被顯著延長,特別是在15℃時λ達到了111.8h.

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水厭氧生物處理研究.

Response of methanogens on temperature stress in an UASB reactor.

ZHANG Li-guo1, BAN Qiao-ying1*, LI Jian-zheng2(1.College of Environment and Resource, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1082～1086

Abstract：The effects of temperature stress on different nutrition type methanogens in an upflowed anaerobic sludge blanket (UASB) reactor was investigated by batch culture. The results showed that the dominant hydrogenotrophic and acetotrophic methanogens in this reactor were Methanospirillum and Methanosaeta, respectively. Under 35℃ condition, the accumulative methane production from hydrogenotrophic and acetotrophic methanogens were 24.7 and 11.7mL, separately. And the maximum methane production rate (Rmax) were 0.74 and 0.18mL/h, respectively. Temperature decreases, from 35℃ to 30, 25, 20, 15℃, resulted in accumulative methane productions from hydrogenotrophic methanogens were decreased by 14.2%, 34.0%, 47.0%, 57.5%, respectively. While those from acetotrophic methanogens were reduced by 5.1%, 23.9%, 45.3%, 95.7%, separately. These results indicated that hydrogenotrophic methanogens are more sensitive to temperature tress at 20～30℃, while acetotrophic methanogens are more sensitive at ≤15℃.

Key words：UASB reactor；methanogens；temperature stress；methane production

作者簡介：張立國(1980-),男,河南安陽人,講師,博士,主要從事廢

基金項目：國家自然科學基金項目(51508316);山西省基礎研究項目(2015021136,2015021134)

收稿日期：2015-09-18

中圖分類號：X703.5

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)04-1082-05