穆希巖,黃 瑛,沈公銘,柴婷婷,朱麗珍,李緒興,雷云雷,馮庚菲,李應(yīng)仁,李學(xué)鋒*,王成菊*(.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 0093；.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心,北京 004)

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苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚(yú)抗氧化酶的影響

穆希巖1,2,黃 瑛2,沈公銘2,柴婷婷1,朱麗珍1,李緒興2,雷云雷2,馮庚菲2,李應(yīng)仁2,李學(xué)鋒1*,王成菊1*(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,北京 100193；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心,北京 100141)

摘要：以斑馬魚(yú)為模式生物研究了三唑類(lèi)殺菌劑苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚(yú)腦和肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和谷胱甘肽還原酶(GR)四種抗氧化酶活性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn):苯醚甲環(huán)唑暴露后,斑馬魚(yú)腦中CAT酶活性隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì).50μg/L及更高濃度的苯醚甲環(huán)唑能夠顯著抑制斑馬魚(yú)腦和肝臟中GPx的活性,且對(duì)腦中GPx活性的抑制程度更強(qiáng).另外,500μg/L苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)肝臟和腦中GR活性表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì),肝臟中GR活性下降,而腦中GR活性升高.上述結(jié)果表明50μg/L的苯醚甲環(huán)唑即可影響斑馬魚(yú)的抗氧化系統(tǒng),其對(duì)農(nóng)業(yè)水域中的魚(yú)類(lèi)影響值得重視.

關(guān)鍵詞：苯醚甲環(huán)唑；斑馬魚(yú)；抗氧化酶；腦；肝臟

* 責(zé)任作者, 教授, lxf1966@263.net; wangchengju@cau.edu.cn

三唑類(lèi)化合物具備高化學(xué)和光化學(xué)穩(wěn)定性、低生物降解性以及容易在環(huán)境中轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),這些特性使得三唑類(lèi)殺菌劑能夠在環(huán)境中的水和土壤中長(zhǎng)期存在[1].作為銷(xiāo)量最大的三唑類(lèi)農(nóng)藥之一,苯醚甲環(huán)唑是先正達(dá)公司開(kāi)發(fā)的三唑類(lèi)內(nèi)吸型殺菌劑[2],兼具保護(hù)和治療的雙重活性,殺菌譜廣,對(duì)多種菌屬有持久的保護(hù)和治療作用.其殺菌原理在于能夠抑制羊毛甾醇去甲基酶(CYP51)活性,從而阻礙菌類(lèi)麥角甾醇的合成,并進(jìn)一步影響細(xì)胞壁的形成,造成細(xì)胞質(zhì)外溢,最終導(dǎo)致病原菌死亡[3-5].

近年,很多研究報(bào)道了苯醚甲環(huán)唑在環(huán)境中的檢出情況(表1),其在農(nóng)作物種植地區(qū)附近的地表水域中的檢出濃度達(dá)到0.3mg/L;而在非農(nóng)業(yè)地區(qū)的地表水中檢出最大值也可達(dá)0.15μg/L.根據(jù)歐洲食品安全局2010年的出版物提供的數(shù)據(jù),苯醚甲環(huán)唑?qū)Υ笮蜏?Daphnia magna)具有高毒性(慢性NOEC為5.6μg/L),苯醚甲環(huán)唑也因此被認(rèn)為對(duì)水生生物具有高風(fēng)險(xiǎn)性[12].在我國(guó)南方,很多地區(qū)采用稻田養(yǎng)殖的方法來(lái)提高經(jīng)濟(jì)效益[13-14],而苯醚甲環(huán)唑作為水稻常用農(nóng)藥,其對(duì)稻田中養(yǎng)殖的水生生物具有潛在威脅.

已有研究表明三唑類(lèi)農(nóng)藥能夠誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)的氧化應(yīng)激作用.Li等[15]的研究發(fā)現(xiàn),0.2μg/L的丙環(huán)唑處理虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)30d后,肝臟中SOD活性顯著提高;而當(dāng)處理濃度達(dá)到50μg/L時(shí),SOD和CAT活性均出現(xiàn)上升.Vasylkiv 等[16]的研究證明,用三唑類(lèi)除草劑殺草強(qiáng)注射處理金魚(yú)(Carassius auratus)24h后,金魚(yú)肌肉、腎臟、心臟、肝臟和腦組織均中CAT活性均顯著下降,下降率分別為61%、64%、48%、40%和27%.而目前關(guān)于苯醚甲環(huán)唑?qū)︳~(yú)類(lèi)抗氧化系統(tǒng)影響的研究還很少.

表1　苯醚甲環(huán)唑在環(huán)境水域中的含量Table 1　The reported environmental difenoconazole dosage in water area.

斑馬魚(yú)作為模式生物具有很多優(yōu)勢(shì),包括成魚(yú)個(gè)體小、易于大規(guī)模養(yǎng)殖、繁殖率高、成本低等.本試驗(yàn)研究了苯醚甲環(huán)唑15d暴露后,斑馬魚(yú)成魚(yú)腦和肝臟中四種抗氧化酶活性的變化情況,旨在探討三唑類(lèi)農(nóng)藥對(duì)斑馬魚(yú)抗氧化系統(tǒng)的損害作用及可能的作用機(jī)制,揭示三唑類(lèi)農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)生理功能的影響.

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)與飼養(yǎng)條件

斑馬魚(yú)成魚(yú),購(gòu)于北京高峰水族館,體長(zhǎng)3.00～4.00cm,體重0.15～0.30g.在試驗(yàn)室馴養(yǎng)30d以上,馴養(yǎng)用水經(jīng)曝氣去氯處理,pH值為7.0～8.5,水中溶氧量飽和度大于80%,水溫為(27±1)℃.采用自然光照與白熾燈光照,光照周期為14/10 (光/ 暗).馴養(yǎng)期間每天喂食2次去殼活豐年蝦(Eubranchipus vernalis),每天換水1/3.馴養(yǎng)期間死亡率小于5%.

1.2 藥品與試劑

96%苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole,CAS: 119446-68-3)原藥為農(nóng)業(yè)部藥檢所提供;原藥由丙酮(分析純)配制成一定濃度的農(nóng)藥儲(chǔ)存液,儲(chǔ)存液進(jìn)一步用重組水稀釋至指定濃度.重組水配置方法參考OECD的推薦方法[17],配好的重組水中含有2mmol/L Ca2+、0.5mmol/L Mg2+、0.75mmol/L Na+和0.074mmol/L K+.

1.3 苯醚甲環(huán)唑暴露試驗(yàn)

參照國(guó)家環(huán)?？偩种贫ǖ摹痘瘜W(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中“魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)”和OECD-203設(shè)計(jì)試驗(yàn)[17-18].參考本試驗(yàn)組已發(fā)表論文中苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚(yú)的急性毒性數(shù)據(jù)(96h-LC50為1.45mg/L)[19],確定暴露濃度.將隨機(jī)挑選的斑馬魚(yú)成魚(yú)暴露于1, 50, 500μg/L的苯醚甲環(huán)唑溶液中;分別設(shè)溶劑對(duì)照和空白對(duì)照.除空白對(duì)照外,其余各處理組的暴露溶液中均含有相同含量的丙酮(0.05mL/L).暴露試驗(yàn)在5L燒杯中進(jìn)行,每個(gè)燒杯中盛有藥液5L和15條魚(yú),每個(gè)暴露組和對(duì)照組均有6個(gè)燒杯,每2個(gè)燒杯一組(共30條魚(yú)),作為1個(gè)重復(fù).試驗(yàn)期間每天飼喂干飼料1次,飼喂量為魚(yú)體重的1%.暴露試驗(yàn)持續(xù)15d,每天觀察魚(yú)的死亡情況,及時(shí)清理死魚(yú),判斷死魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)是玻璃棒輕觸魚(yú)的尾部無(wú)可見(jiàn)運(yùn)動(dòng).每24h更換全部藥液以保持穩(wěn)定的測(cè)試物濃度和潔凈的水質(zhì).每周檢測(cè)水溫、pH值和溶氧量各3次.

1.4 樣品收集及前處理

分別在暴露后3,8,15d時(shí),從每個(gè)重復(fù)組中選取6條斑馬魚(yú),用MS-222溶液于冰上麻醉后,迅速取出腦和肝臟組織,并放于1.5mL離心管中,稱重后置于液氮中臨時(shí)保存,樣品全部取完后,統(tǒng)一存放于-80℃冰箱中.用于生化指標(biāo)測(cè)定.

將冷凍樣品在冰上解凍后,加入150μL預(yù)冷的磷酸緩沖溶液,用電動(dòng)勻漿器充分勻漿后繼續(xù)加入適量磷酸緩沖溶液并充分混勻,保證勻漿液質(zhì)量體積比為1:20(m/V).混勻后的勻漿液在4℃下14000r/ min離心30min后,吸取上清液用于酶活性檢測(cè).

1.5 暴露溶液中苯醚甲環(huán)唑含量分析

在第一次配好藥液后,以及每次取斑馬魚(yú)樣品之前,從燒杯中取水樣20mL進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑含量分析,每個(gè)處理組取3個(gè)重復(fù)樣品.將樣品倒入分液漏斗中,用10mL乙酸乙酯萃取2次后,合并萃取液.每個(gè)樣品取約1mL萃取液用氮?dú)獯蹈珊?加入1mL乙腈重新溶解.將重新溶解的樣品通過(guò)0.22μm的濾膜后,使用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析檢測(cè).色譜及質(zhì)譜分析條件參考本課題組已發(fā)表方法[20].

1.6 酶活性測(cè)定

CAT活性檢測(cè)以Beers等[21]的方法為基礎(chǔ)并進(jìn)行一定的改進(jìn).反應(yīng)體系為900μL的磷酸鉀緩沖溶液(50mmol/L,pH7.0,含有10mmol/L的過(guò)氧化氫),和100μL酶液.在室溫(24℃ )下開(kāi)始反應(yīng),并記錄反應(yīng)后3分鐘內(nèi)的吸光值變化.以每分鐘清除1mmol/L H2O2所需要的蛋白質(zhì)質(zhì)量為一個(gè)酶活單位,計(jì)算時(shí)使用的H2O2的摩爾吸光系數(shù)為40mol/(L·cm).酶活單位用U/mg蛋白質(zhì)表示.

谷胱甘肽還原酶(GR)活性的分析方法參考Mu等[22]的方法測(cè)定.1mL的反應(yīng)體系含有900μL的磷酸鈉緩沖溶液(0.1mol/L,pH:7.6,含有0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.5mmol/L的EDTA)和100μL的酶液樣品.在26

℃下開(kāi)始反應(yīng),并記錄開(kāi)始反應(yīng)后3min內(nèi)的吸光值變化.以每分鐘氧化1μmol/L的NADPH所需要的蛋白質(zhì)質(zhì)量為一個(gè)酶活單位,計(jì)算時(shí)使用的NADPH的摩爾吸光系數(shù)為6220mol/(L·cm).酶活單位用U/mg蛋白質(zhì)表示.

SOD和GPx的活性測(cè)定使用試劑盒(南京建成,南京)進(jìn)行測(cè)定.酶活性計(jì)算方法參照試劑盒配套的使用手冊(cè)完成.

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 16.0對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.采用One-Way ANOVA法進(jìn)行單因素方差分析,以Dunnett post hoc方法完成顯著性比較; P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著.

2　結(jié)果與討論

2.1 溶劑效應(yīng)

顯著性分析結(jié)果表明,溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組中試驗(yàn)涉及的所有指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果之間不存在顯著差異(數(shù)據(jù)未給出).在本文中出現(xiàn)的對(duì)照組(control)數(shù)據(jù)均來(lái)自于溶劑對(duì)照.

2.2 苯醚甲環(huán)唑分析結(jié)果

分析結(jié)果表明所有處理組水樣的實(shí)測(cè)濃度與理論濃度偏差均小于20%(表2),根據(jù)OECD試驗(yàn)指導(dǎo)的要求,本試驗(yàn)中的理論濃度能夠代表其實(shí)際濃度[23].

表2　苯醚甲環(huán)唑暴露溶液實(shí)測(cè)濃度Table 2　Chemical analysis result of difenoconazole solution

2.3 抗氧化酶活性變化

2.3.1 SOD活性變化 由圖1可知,苯醚甲環(huán)唑處理后3d和8d時(shí),斑馬魚(yú)腦中SOD活性未出現(xiàn)明顯變化,當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到15d時(shí),50μg/L處理組中斑馬魚(yú)腦SOD活性顯著下降,活性約為對(duì)照組的80%.斑馬魚(yú)肝臟在1μg/L苯醚甲環(huán)唑暴露8d 后,SOD活性顯著上升.其余處理組中肝SOD活性在各時(shí)間點(diǎn)變化均不明顯.

圖1　苯醚甲環(huán)唑處理后斑馬魚(yú)腦和肝臟中SOD活性Fig.1　The activity of SOD in brain and liver tissue of zebrafish*代表處理組與對(duì)照組的顯著性差異,P<0.05,*

當(dāng)生物體內(nèi)的氧化劑與抗氧化劑比率失衡時(shí),就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用,該作用還能進(jìn)一步對(duì)生物體內(nèi)的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和核酸等物質(zhì)造成氧化損傷[24].活性氧(ROS)的大量激增是氧化應(yīng)激作用的主要表現(xiàn)形式,而過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷[25].生物體內(nèi)的解毒過(guò)程是多種酶的共同作用的結(jié)果,首先在SOD的作用下,將ROS轉(zhuǎn)化成為H2O2,而產(chǎn)生的H2O2 由CAT和GPx進(jìn)一步分解為水和氧氣[26].因此,測(cè)試抗氧化酶的活性被認(rèn)為是鑒別生物體內(nèi)氧化應(yīng)激作用的一種有效方法.

Zhu等[27]測(cè)定了5種三唑類(lèi)農(nóng)藥(腈菌唑、氟康唑、氟硅唑、氟菌唑和氟環(huán)唑)對(duì)稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)胚胎SOD活性的影響,發(fā)現(xiàn)0.2mg/L氟康唑和腈菌唑處理72h時(shí)后,稀有鮈鯽胚胎SOD活性顯著上升,而另外3種三唑類(lèi)農(nóng)藥在該濃度下對(duì)SOD活性無(wú)顯著影響;當(dāng)處理濃度達(dá)到1.0mg/L時(shí),除氟硅唑外,4種三唑類(lèi)農(nóng)藥均能顯著誘導(dǎo)稀有鮈鯽胚胎中SOD活性;而當(dāng)處理濃度提高至5mg/L時(shí),5種三唑類(lèi)農(nóng)藥對(duì)稀有鮈鯽胚胎中SOD活性產(chǎn)生明顯的抑制作用.該研究表明,三唑類(lèi)化合物在不同暴露濃度下,對(duì)魚(yú)類(lèi)SOD活性的影響趨勢(shì)不同.Li等[15]發(fā)現(xiàn),50μg/L丙環(huán)唑處理30d后,能夠誘導(dǎo)虹鱒魚(yú)腦中SOD活性顯著上升.與上述結(jié)果不同,苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)腦和肝臟中SOD活性變化未見(jiàn)明顯規(guī)律.這說(shuō)明不同三唑類(lèi)農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類(lèi)抗氧化系統(tǒng)的影響可能存在差異.

2.3.2 CAT活性變化 由圖2可知,在暴露后3d 時(shí),50,500μg/L處理組中斑馬魚(yú)腦CAT活性顯著升高,活性分別為對(duì)照組的1.4倍和1.5倍.在8d 時(shí),50μg/L組中腦CAT活性回復(fù)至正常水平,500μg/L組中腦CAT活性仍顯著高于對(duì)照組,約為對(duì)照組的1.25倍.而當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到15d 時(shí),50,500μg/L處理組中斑馬魚(yú)腦CAT活性較對(duì)照組顯著下降,活性分別為對(duì)照組的67%和65%.

在暴露后3d時(shí),所有處理組中斑馬魚(yú)肝CAT活性均低于對(duì)照組,其中50,500 μg/L組CAT活性甚至不足對(duì)照組的50%.在8d時(shí),所有暴露組CAT活性均顯著低于對(duì)照組,各組斑馬魚(yú)肝臟CAT活性分別為對(duì)照組的77%、59%和71%.當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到15d后,1 μg/L組斑馬魚(yú)肝CAT活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異,而50,500μg/L組中CAT活性仍顯著低于對(duì)照組,分別為對(duì)照組的68%和63%.

一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三唑類(lèi)化合物能夠影響水生生物體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶活性,Li等[28]發(fā)現(xiàn),以致死中濃度(LC50)劑量的丙環(huán)唑處理虹鱒魚(yú)后,虹鱒魚(yú)肝臟中CAT活性升高,而同時(shí)鰓中CAT活性下降,該研究反映出三唑類(lèi)化合物處理后,不同組織的氧化應(yīng)激效應(yīng)可能存在差異.Bagnyukova等[29]的研究結(jié)果表明,三唑類(lèi)除草劑殺草強(qiáng)暴露后,金魚(yú)(Carassius auratus)腦中CAT活性顯著下降,且下降呈明顯的濃度梯度效應(yīng).本試驗(yàn)組之前的研究也發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑短期處理8d后,斑馬魚(yú)胚胎和成魚(yú)肝臟中CAT活性顯著下降,同時(shí)伴隨CAT酶的編碼基因表達(dá)下調(diào)[30].在本研究中,苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)腦和肝臟中的CAT活性均出現(xiàn)顯著變化.其中肝臟中CAT的變化情況更加明顯,在檢測(cè)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)中,暴露組中斑馬魚(yú)肝臟CAT活性均顯著低于對(duì)照組.這一結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果相符合[30].另外,與其他3種酶相比,CAT在肝臟中表現(xiàn)出的應(yīng)激反應(yīng)更為迅速、明顯,其活性在暴露后第3d就出現(xiàn)顯著變化;而SOD、GR和GPx 3種酶的活性在暴露8d后才出現(xiàn)顯著變化.

圖2　苯醚甲環(huán)唑處理后斑馬魚(yú)腦和肝臟中CAT活性Fig.2　The activity of CAT in brain and liver tissue of zebrafish*代表處理組與對(duì)照組的顯著性差異(P<0.05, *; P<0.01, **)

苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)腦CAT活性變化呈現(xiàn)出基于暴露時(shí)間的不同趨勢(shì).在暴露后3d和8d時(shí),CAT活性上升;而在15dpe時(shí),CAT活性下降.Li等[31]的研究發(fā)現(xiàn)0.5mg/L丙環(huán)唑處理7d后,虹鱒魚(yú)腦中CAT活性顯著上升,而在暴露后15d 和30d時(shí),CAT活性顯著低于對(duì)照組,該結(jié)果中CAT酶活性變化趨勢(shì)與本研究相同.CAT能夠催化H2O2生成水和氧氣,從而減輕自由基對(duì)魚(yú)體的氧化損傷.當(dāng)污染物處理濃度在一定范圍內(nèi)累積增加,活性氧自由基的大量產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)CAT催化反應(yīng),使其活性增強(qiáng)[32],這可能是本試驗(yàn)中8d之前CAT活性上升的原因.然而隨著暴露濃度的增加或暴露時(shí)間的延長(zhǎng),一旦污染物在生物體內(nèi)的含量達(dá)到一定濃度,就會(huì)導(dǎo)致包括抗氧化酶在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)酶受損,從而其清除活性氧的功能也隨之喪失[33].因此,本研究中出現(xiàn)的CAT活性下降,很可能是斑馬魚(yú)腦中抗氧化能力不足的信號(hào)[34].類(lèi)似的CAT活性變化趨勢(shì)也出現(xiàn)在高效氯氰菊酯處理后的斑馬魚(yú)中[22].而苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)肝臟中CAT活性僅出現(xiàn)下降,并未見(jiàn)上升,這可能是由于肝臟作為主要代謝解毒器官,其氧化應(yīng)激作用的敏感性更強(qiáng),反應(yīng)更快,在第一次取樣前CAT活性已經(jīng)完成了由升高到降低的調(diào)節(jié)過(guò)程.周常義等[35]的研究發(fā)現(xiàn),三唑磷處理后,泥蚶(Tegillarca granosa)血液中的CAT活性在暴露后第1d時(shí)顯著上升,而從暴露后第2d開(kāi)始, CAT活性即顯著低于對(duì)照組,該研究表明暴露于三唑類(lèi)化合物后,CAT活性由上升到下降的趨勢(shì)變化過(guò)程可能只需較短時(shí)間,支持了上述假設(shè).

2.3.3 GR活性變化 由圖3可知,在暴露后3d 時(shí),1μg/L處理組中斑馬魚(yú)腦GR活性顯著升高,活性約為對(duì)照組的1.5倍.而在8d時(shí),各處理組GR活性與對(duì)照組均無(wú)顯著差異.暴露15d后,50, 500μg/L處理組中斑馬魚(yú)腦GR活性較對(duì)照組顯著上升.

斑馬魚(yú)肝臟中GR活性在暴露后3d和8d時(shí)均未發(fā)生顯著變化,當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到15d時(shí), 1μg/L和500μg/L處理組中斑馬魚(yú)肝GR活性顯著下降,分別為對(duì)照組的65%和72%.

本研究中,苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)腦和肝臟中GR活性變化趨勢(shì)不同,其中腦中GR活性上升,而肝臟中GR活性顯著降低.Mu等[22]的研究發(fā)現(xiàn),高效氯氰菊酯處理30d后,斑馬魚(yú)腦中GR活性升高,而肝臟中GR活性下降,該研究結(jié)果趨勢(shì)與本研究相似.谷胱甘肽還原酶的功能是維持細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的含量.調(diào)控GR活性變化的機(jī)制目前尚不明確,但是有研究認(rèn)為氧化態(tài)谷胱甘肽(GSSG)含量升高,可能是誘導(dǎo)GR活性的關(guān)鍵因素[36].因此后續(xù)研究可通過(guò)測(cè)定苯醚甲環(huán)唑處理后,目標(biāo)組織中的GSSG含量變化,來(lái)進(jìn)一步明確GR活性變化的機(jī)理.

圖3　苯醚甲環(huán)唑處理后斑馬魚(yú)腦和肝臟中GR活性Fig.2　The activity of GR in brain and liver tissue of zebrafish*代表處理組與對(duì)照組的顯著性差異(P<0.05, *; P<0.01, **)

2.3.4 GPx活性變化 由圖4可知,500μg/L苯醚甲環(huán)唑能夠顯著抑制斑馬魚(yú)腦中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性,且抑制程度隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,不同取樣時(shí)間時(shí)500μg/L組GPx活性分別相當(dāng)于對(duì)照組的79%(3d)、73%(8d)和48%(15d).50μg/L組的GPx活性在15d時(shí),也出現(xiàn)顯著下降,約為對(duì)照組的50%.

圖4　苯醚甲環(huán)唑處理后斑馬魚(yú)腦和肝臟中GPx活性Fig.4　The activity of GPx in brain and liver tissue of zebrafish*代表處理組與對(duì)照組的顯著性差異(P<0.05, *; P<0.01, **)

在暴露后3d時(shí),苯醚甲環(huán)唑處理對(duì)斑馬魚(yú)肝臟中GPx活性無(wú)明顯影響.而在暴露后8d時(shí), 500μg/L組中GPx活性較對(duì)照組顯著下降.當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至15d時(shí),50,500μg/L處理組中GPx活性均顯著低于對(duì)照組,酶活性分別為對(duì)照組的77%和80%.

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶被認(rèn)為是能夠有效防止脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)性酶,它能催化過(guò)氧化氫的還原反應(yīng),對(duì)由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化物及過(guò)氧化氫有極強(qiáng)的清除能力,從而保護(hù)生物大分子和生物膜結(jié)構(gòu)免受過(guò)氧化物損傷[37]. Li等[38]的研究發(fā)現(xiàn),丙環(huán)唑長(zhǎng)期處理后,虹鱒魚(yú)肝臟中GPx活性顯著升高;與此同時(shí)鰓和肌肉中的GPx活性顯著下降.李紅艷等[39]的研究發(fā)現(xiàn),三唑磷暴露3d和7d時(shí),斑節(jié)對(duì)蝦鰓中GPx活性被顯著抑制,但當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到14d時(shí),GPx活性較對(duì)照組顯著升高.在本研究中,苯醚甲環(huán)唑處理后,斑馬魚(yú)腦和肝臟中GPx活性均出現(xiàn)下降,其中腦中GPx活性下降程度更大.腦中含有大量容易被氧化的多不飽和脂肪酸[40],在暴露于外源有毒物質(zhì)后,很容易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化,因此迫切需要激活GPx,以消除脂質(zhì)過(guò)氧化物;然而腦自身并非解毒代謝器官,自身抗氧化能力有限,因此可能出現(xiàn)GPx抗氧化系統(tǒng)的失調(diào),進(jìn)一步導(dǎo)致其活性下降.Li等[31]研究了丙環(huán)唑?qū)琪V魚(yú)腦中抗氧化系統(tǒng)的影響,發(fā)現(xiàn)在7d時(shí),虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)腦中GPx活性無(wú)明顯變化且未出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化;當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到20d后,虹鱒魚(yú)腦中GPx活性顯著下降,同時(shí)伴隨脂質(zhì)過(guò)氧化物含量顯著升高.該研究結(jié)果與本文中的結(jié)果及推論相一致. 2.4 環(huán)境中苯醚甲環(huán)唑?qū)︳~(yú)類(lèi)的氧化應(yīng)激作用根據(jù)本研究的結(jié)果,1μg/L的苯醚甲環(huán)唑就能引起斑馬魚(yú)腦和肝臟中的抗氧化酶活性出現(xiàn)變化,而50μg/L的苯醚甲環(huán)唑能夠?qū)Π唏R魚(yú)的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生比較明顯的干擾作用.結(jié)合表1可知,目前苯醚甲環(huán)唑在普通地表水中的檢出濃度均遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)中能引起斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激作用的濃度.但是應(yīng)注意在靠近農(nóng)業(yè)區(qū)的水域中,苯醚甲環(huán)唑可達(dá)較高水平(0.3mg/L),因此苯醚甲環(huán)唑?qū)r(nóng)業(yè)水域中的魚(yú)類(lèi),尤其是在稻田中飼養(yǎng)的家魚(yú)的影響應(yīng)得到重視.

3　結(jié)論

3.1 斑馬魚(yú)腦中CAT活性在苯醚甲環(huán)唑暴露后3d時(shí)顯著高于對(duì)照組;而在苯醚甲環(huán)唑暴露后15d時(shí),顯著低于對(duì)照組.50μg/L或更高濃度的苯醚甲環(huán)唑能夠顯著抑制斑馬魚(yú)肝臟中CAT活性. 3.2 50μg/L或更高濃度的苯醚甲環(huán)唑能夠顯著抑制斑馬魚(yú)腦和肝臟中的GPx活性,其中斑馬魚(yú)腦中GPx被抑制程度更強(qiáng).

3.3 50μg/L的苯醚甲環(huán)唑能夠?qū)Π唏R魚(yú)的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生較明顯的干擾作用,而該濃度低于農(nóng)業(yè)水域中苯醚甲環(huán)唑的濃度,其對(duì)農(nóng)業(yè)水域中的魚(yú)類(lèi)影響值得重視.

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Abstract：To investigate the effect of difenoconazole on zebrafish antioxidases, adult zebrafish were exposed to three concentrations of difenoconazole for 15days. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) was measured at 3, 8 and 15 days post exposure (dpe) respectively. Results indicated that the brain CAT activity was increased at 3 and 8 dpe but decreased at 15 dpe. 50μg/L or higher difenoconazole could inhibit brain and hepatic GPx activity of zebrafish, and the inhibition in brain was stronger than liver. In addition, brain GR activity was induced by 500μg/L difenoconazole while hepatic GR activity was reduced under the same exposure. These results implicated that 50μg/L could alter the antioxidant system of zebrafish and its effects on fish living in agricultural water areas should be concerned.

Key words：difenoconazole；zebrafish；antioxidase；brain；liver

作者簡(jiǎn)介：穆希巖(1987-),男,北京人,中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院資源與環(huán)境研究中心助理研究員,主要研究方向?yàn)闈O業(yè)生態(tài)環(huán)境.發(fā)表論文12篇.

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部科研專(zhuān)項(xiàng),農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估綜合配套技術(shù)研究-水生生物慢性毒性方法(200903054-02);農(nóng)業(yè)部財(cái)政項(xiàng)目物種資源保護(hù)(2130135)

收稿日期：2015-09-20

中圖分類(lèi)號(hào)：X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-6923(2016)04-1242-09