章 妮， 陳克龍， 祁 聞， 暴 涵

(1.青海師范大學 生命科學學院，青海 西寧 810008；2.青海師范大學 青海省自然地理與環(huán)境過程重點實驗室，青海 西寧 810008；3.青海師范大學 科技處，青海 西寧 810008；4.青海師范大學 地理科學學院，青海 西寧 810008)

近年來，化石燃料的大量燃燒和土地利用變化導致大氣中溫室氣體濃度急劇增加，全球氣候變化加劇[1-2]。自1960年至今，全球年平均氣溫增加近2 ℃[3]，預計至2100年將增加4 ℃以上[4-6]，這將極大程度影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。甲烷(CH4)是僅次于二氧化碳(CO2)的第二大溫室氣體，其全球變暖潛力是二氧化碳的25倍，對全球變暖的貢獻高達20%[7]。地球大氣化學循環(huán)中，甲烷有著重要的地位，其大氣濃度直接影響地球氣候[8]，同時顯著影響土壤環(huán)境的穩(wěn)定性[9-10]。青藏高原作為一個獨特的生態(tài)系統(tǒng)，平均海拔4 000 m以上，被稱為地球第三極[11]，對氣候變化極為敏感[12-13]。過去的幾十年里，青藏高原的氣候變化呈現(xiàn)明顯的變暖和降水增加的趨勢[14]。高溫、強降雨等極端天氣事件越來越多地在當?shù)貧庀笳居^測到[15]。青藏高原東北部的青海湖流域，為高緯度國際重要濕地，也是我國重要的生態(tài)功能調節(jié)區(qū)。其氣候變化具有異質性，對溫度變化極為敏感[16]，受氣候變化影響顯著，30年的年平均氣溫升高約0.9 ℃[17]。另有研究表明，對比低海拔地區(qū)，高海拔生態(tài)系統(tǒng)受氣候變化引起的土壤環(huán)境因素的變化更大[18]。因此，探究溫度升高后青海湖流域土壤環(huán)境對增溫的響應及其機制是非常必要的。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)不可分割的一部分，在推動碳、氮、磷、硫等元素的生物地球化學循環(huán)以及維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的過程和功能方面發(fā)揮著非常重要的作用[19-21]，驅動了大量的生態(tài)系統(tǒng)過程[22]，部分微生物菌群也是生態(tài)系統(tǒng)對氣候變化響應的核心[23]。土壤微生物是優(yōu)于土壤理化因素的環(huán)境指示因子，其生物量和群落結構變化是對外界環(huán)境的早期響應指標[24-26]。有研究表明，土壤微生物對微環(huán)境具有高敏感性，對溫度變化響應明顯[27]。溫度變化不僅可以直接影響土壤微生物的生活，還可能通過蒸散發(fā)、植物生理、根系分泌和植被的變化來間接影響土壤微生物的生活[28-29]。因此，土壤微生物對氣候變化的響應方向和程度存在一定的不確定性[30-31]。Iqbal等[32]的研究表明，甲烷相關的微生物菌群是識別濕地狀態(tài)的最佳指標。濕地生態(tài)系統(tǒng)的甲烷排放量占全球甲烷排放通量的20%～40%[33]，是自然環(huán)境中甲烷最大的排放源[34]。土壤中棲息的產甲烷菌通過新陳代謝產生大量甲烷[35-36]，在濕地甲烷排放中起著至關重要的作用[37-38]。截至目前，對高寒濕地的土壤產甲烷菌群落的研究較少，有關青海湖鳥島微生物群落的研究還停留在探究細菌以及真菌的群落特征上[39]。本研究旨在利用高通量測序的方法來探究溫度升高后青海湖鳥島這一湖濱濕地產甲烷菌群落的結構組成以及多樣性特征的變化，以期了解高寒濕地產甲烷菌群落相關的甲烷排放機制，同時為深入探究濕地的碳循環(huán)機制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)域概況 研究樣地為鳥島國家自然保護區(qū)，該區(qū)位于青海湖西北角的湖濱濕地，地理位置東經99°44′ ～ 99°54′，北緯36°57′ ～ 37°04′；海拔3 194 ～ 3 226 m，地勢西北高、東南低。原生草地以直立黃芪 (AstragalusadsurgensPall)、甘青韭 (Alliumprzewalskianum)、賴草 (Leymussecalinus)、西伯利亞蓼 (PolygonumsibiricumLaxm)、早熟禾 (PoaannuaL)、細葉苔草 (Carexrigescens) 為優(yōu)勢植物種。該區(qū)為高原半干旱高寒氣候區(qū)，年平均氣溫-0.7 ℃，年最高溫度28 ℃、最低溫度-31 ℃。年平均降水量322.7 mm，6～8月降水尤為集中，且年蒸發(fā)量遠高于年降水量。

1.1.2 土壤樣品采集 增溫處理采用開頂箱 (Open-Top Chamber, OTC) 于2017年在鳥島選取50 m×50 m樣地，樣地內選取4 m×4 m小樣方布設OTC，其上表面直徑150 cm，邊長87 cm；下表面直徑208 cm，邊長122 cm；增溫幅度約1.2 ℃。于設置增溫裝置的第3年，即2020年6月上旬的生長季初期采集土壤樣品。實驗設置5個重復，對增溫圈(NW)以及自然區(qū)(Nck)土壤進行采集。以5點取樣法隨機取樣，同層土壤混勻后過2 mm篩，于10 mL的EP管保存土壤樣品，置于液氮罐中保鮮，用于土壤產甲烷菌的高通量測序。

1.1.3 試劑與儀器 PowerSoil DNA提取試劑盒(MoBio公司)；AxyPrep PCR純化試劑盒(Axygen公司)。PCR儀(ABI GeneAmp?9700，美國ABI公司)；Illumina PE150測序儀(Illumina公司)。

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA提取及測序 PowerSoil DNA試劑盒提取土壤總DNA。檢測合格的DNA樣品經瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，AxyPrep PCR純化提取的DNA，擴增過程用帶Barcode序列的土壤產甲烷菌特異引物進行[40-41]，即mcrA基因的正向引物 (GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC)以及反向引物 (TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT)，完成文庫的制備。文庫構建完成后，稀釋文庫至 2 ng/μL，隨后檢測文庫是否符合預期，最后對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>3 nmol/L)，以保證文庫質量。庫檢合格后，按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求進行Illumina PE150測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 經高通量測序得到原始數(shù)據(jù) (Raw Data)，PANDASEQ拼接[42]、PRINSEQ質控過濾[43]、CD-HIT去冗余[44]獲得有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。優(yōu)化序列基于proGenomes(http://progenomes.embl.de/)數(shù)據(jù)庫經UCLUST[45]軟件以97%的相似度聚類得到操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)數(shù)目以及韋恩圖，同時生成不同分類水平的物種豐度表。Mothur軟件[46]評估α-多樣性，Qiime[47]分析β-多樣性。多因素方差分析采用SPSS 21.0進行ANOVA分析，檢驗各分組間數(shù)據(jù)的顯著性。

2 結果與分析

2.1 鳥島土壤產甲烷菌OTUs分布

高通量測序結果顯示，鳥島土壤產甲烷菌OTU數(shù)為679個。韋恩圖表明(圖1)，不同分組間共有的OTU數(shù)目為597個，增溫處理土壤 (NW) 的特有OTU數(shù)目為43個，自然狀態(tài)土壤的特有OTU數(shù)目較少，為39個。表明溫度升高對鳥島土壤產甲烷菌的種類有一定的影響。

圖1 鳥島土壤產甲烷菌群落韋恩圖Fig.1 Venn diagram of methanogenic bacteria community in the soil of Bird Island

2.2 鳥島土壤產甲烷菌群落Alpha多樣性

基于多樣性指數(shù)構建樣品稀釋性曲線，驗證測序數(shù)據(jù)量的合理性。圖2A表明，絕大多數(shù)樣品的稀釋曲線趨于平緩，表明土壤產甲烷菌的測序量使得多樣性指數(shù)變化趨于飽和，再次增加測序深度后，多樣性指數(shù)不會大幅波動，測序深度足以進行后續(xù)分析。

多樣性指數(shù)可以反映群落的豐富度以及均勻度(圖2B)。鳥島土壤產甲烷菌群落的多樣性指數(shù)包含Observe指數(shù)(范圍為314～559)、ACE指數(shù)(范圍為329～565)、Chao1指數(shù)(范圍為335～564)、Simpson指數(shù)(范圍為0.961 3～0.971 8)、Shannon多樣性指數(shù)(范圍為4.257 7～4.423 2)。ANOVA方差分析顯示，溫度升高對土壤產甲烷菌的群落多樣性沒有顯著影響 (P>0.05)。從整體上看，溫度升高后，鳥島土壤產甲烷菌群落豐富度指數(shù)(Observe、ACE、Chao1)均小幅度下降，群落Simpson及Shannon多樣性指數(shù)也小幅度下降，表明溫度升高對鳥島土壤產甲烷菌群落的多樣性存在一定程度的影響，產甲烷菌種類減少，群落均勻度降低。

圖2 樣品稀釋性曲線 (A) 及產甲烷菌群落多樣性指數(shù) (B)Fig.2 Dilution curve of samples (A) and diversity index of methanogenic bacteria community (B)

2.3 鳥島土壤產甲烷菌群落結構組成

鳥島產甲烷菌均屬于廣古菌門，其目水平有甲烷微菌目 (Methanomicrobiales)、甲烷八疊球菌目 (Methanosarcinales)、甲烷桿菌目 (Methanobacteriales)、 Methanomassiliicoccales以及甲烷孢菌目 (Methanocellales)。鳥島土壤的優(yōu)勢產甲烷菌為甲烷微菌目、甲烷八疊球菌目及甲烷桿菌目，相對豐度占比分別為66.90%、14.36%、10.30%。鳥島屬水平產甲烷菌(圖3A)以相對豐度占比為69.18%的菌群為分類學上的未分類菌群，已知菌群中，存在9個相對豐度大于0.1%的產甲烷菌菌群，分別為甲烷絲菌屬(Methanothrix，13.13%)、甲烷細菌屬(Methanobacterium，9.98%)、Methanomassiliicoccus(3.75%)、CandidatusMethanogranum(1.59%)、Methanoregula(0.79%)、甲烷八疊球菌屬 (Methanosarcina，0.77%)、甲烷胞菌屬 (Methanocella，0.37%)、Methermicoccus(0.17%) 以及甲烷泡菌屬 (Methanofollis，0.14%)，其中前4個菌群的相對豐度較高，均大于1%。

PCoA分析中，橫軸的PC1和縱軸的PC2分別解釋了土壤產甲烷菌群落變異的31%和25%，總解釋率為56%(圖3B)。與對照相比，增溫處理后的土壤產甲烷菌群落發(fā)生了明顯變化。增溫處理的土壤樣品較為分散，可能是由于溫度升高增加了鳥島土壤的異質性，土壤環(huán)境因子相互作用引起了土壤產甲烷菌群落變化。

2.4 鳥島土壤產甲烷菌菌群LEfSe分析

溫度升高影響了鳥島產甲烷菌群落，為尋找增溫處理后產生的與自然狀態(tài)具有統(tǒng)計學差異的Biomaker，本研究采用LEfSe分析發(fā)現(xiàn)分組間的高維生物標識并揭示基因組特征。結果表明，自然狀態(tài) (Wck) 與增溫處理 (WW) 間的土壤產甲烷菌群落存在35個差異菌群(圖4)。大多差異菌群為屬水平及種水平菌群，綱水平和目水平差異菌群數(shù)均為2個，科水平差異菌群為3個。Wck中相對豐度較高的差異菌群為熱原體綱 (Thermoplasmata)、Methanomassiliicoccales目、Methanomassiliicoccaceae科；WW中相對豐度較高的差異菌群為甲烷微菌綱 (Methanomicrobia)、八疊球菌目、甲熱球菌科(Methermicoccaceae) 以及 Methanotrichaceae科。整體上看，溫度升高顯著影響了鳥島產甲烷菌的群落結構，綱水平到種水平的部分菌群相對豐度均變化顯著。

圖3 土壤樣品屬水平產甲烷菌群落組成 (A) 及PCoA主坐標分析 (B)Fig.3 Community composition of horizontal methanogenic bacteria in soil samples (A) and Principal Coordinate analysis of PCoA (B)

圖4 土壤產甲烷菌LEfSe分析Fig.4 Lefse analysis of soil methanogens

2.5 鳥島土壤產甲烷菌群落FAPROTAX功能預測

利用FAPROTAX預測鳥島土壤產甲烷菌的生態(tài)功能，結果表明產甲烷菌共存在15個功能基團(圖5)。大多產甲烷菌的功能基團為甲烷生成 (Methanogenesis，33.51%)、氫營養(yǎng)型甲烷化 (Hydrogenotrophic methanogenesis，28.67%) 以及氫還原二氧化碳生成甲烷 (Methanogenesis by CO2reduction with H2，26.72%)，另有部分功能基團為暗氫氧化 (Dark hydrogen oxidation，3.82%)、化能異養(yǎng) (Chemoheterotrophy，2.44%)、氫還原甲基化合物生成甲烷 (Methanogenesis by reduction of methyl compounds with H2，2.12%)、甲基營養(yǎng) (Methylotrophy，2.12%)。溫度升高對鳥島土壤產甲烷菌的功能沒有顯著影響 (P>0.05)。表明鳥島土壤產甲烷菌群落的功能結構較為穩(wěn)定，大多產甲烷菌均利用H2/CO2的氫營養(yǎng)型途徑產生甲烷。

圖5 產甲烷菌群落FAPROTAX功能預測Fig.5 Prediction of FAPROTAX function of methanogens community

3 討 論

溫度變化直接或間接地影響著土壤微生物群落[28-29]，作為第二大溫室氣體，甲烷的生成與產甲烷菌有著密切的關系[37-38]。本研究通過研究溫度升高對鳥島土壤產甲烷菌群落特征的影響，來探究鳥島湖濱濕地土壤產甲烷菌群落對氣候變暖的響應。結果表明，鳥島土壤產甲烷菌以甲烷微菌目、甲烷八疊球菌目及甲烷桿菌目為優(yōu)勢菌群，這與前人對濕地產甲烷菌群落的研究結果一致[48-50]。溫度升高并未顯著改變鳥島土壤產甲烷菌的群落多樣性，產甲烷菌群落的多樣性指數(shù)均小幅度下降，不存在統(tǒng)計學上的顯著差異。前人對溫度變化影響產甲烷菌群落多樣性的結論各異，部分研究表明產甲烷菌群落豐富度與甲烷排放呈顯著正相關，隨溫度升高顯著增加[51]；另有研究表明，增溫顯著降低了產甲烷菌群落的豐富度及香農多樣性指數(shù)[52]；這種差異可能是由于空間異質性以及模擬增溫的幅度不同所致。Peltoniemi等[53]研究表明，溫度上升后產甲烷菌群落相似，與本研究的結論一致。LEfSe分析結果表明，增溫處理與自然狀態(tài)的土壤產甲烷菌綱水平到科水平的差異菌群數(shù)量分別為2、2、3。增溫處理顯著增加了甲烷微菌綱、八疊球菌目、甲熱球菌科以及Methanotrichaceae的相對豐度，顯著降低了熱原體綱、Methanomassiliicoccales、Methanomassiliicoccaceae的相對豐度。表明自然狀態(tài)與溫度升高后土壤的特征產甲烷菌不同，溫度升高顯著影響了鳥島產甲烷菌群落結構，改變了部分產甲烷菌群的相對豐度，這與Hφj等[54]對北極泥炭中產甲烷菌群落的研究結果一致。也有前人研究表明溫度上升后產甲烷菌群落相對豐度有所下降，甚至有研究表明產甲烷菌群落結構與溫度幾乎沒有關系[52]。這可能受土壤的異質性以及環(huán)境因素交互影響得出了不同結論。鳥島土壤產甲烷菌的FAPROTAX功能預測出15個功能基團，大多產甲烷菌的功能基團為甲烷生成、氫營養(yǎng)型甲烷化以及氫還原二氧化碳生成甲烷，表明大多產甲烷菌利用H2/CO2的氫營養(yǎng)型途徑產生甲烷。

本研究初步探究了青海湖鳥島產甲烷菌群落的結構以及多樣性對溫度升高的響應，為鳥島湖濱濕地甲烷循環(huán)機制的探究提供參考，并提高對全球氣候變化的前瞻性。未來可對土壤含水量、pH值、電導率等土壤理化性質與鳥島土壤產甲烷菌群落的相互關系進一步研究，從而更加深入地探討湖濱濕地的甲烷循環(huán)驅動機理。