王興文王加啟趙圣國李發(fā)弟卜登攀

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070）

未培養(yǎng)技術在瘤胃產(chǎn)甲烷菌群研究中的應用

王興文1，2王加啟1趙圣國1李發(fā)弟2卜登攀1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070）

瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌為嚴格厭氧微生物，很難通過分離培養(yǎng)的方法進行研究?，F(xiàn)已經(jīng)培養(yǎng)并公布的瘤胃產(chǎn)甲烷菌只有4種，成千上萬種類的瘤胃產(chǎn)甲烷菌不能培養(yǎng)出來。未培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用突破了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測方法的限制，使瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究有了較大的進展。綜述了實時定量PCR、16S rDNA文庫、DGGE和高通量測序技術等6項具有代表性的未培養(yǎng)技術及其在瘤胃產(chǎn)甲烷菌研究中的應用，為以后瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究提供方法上的參考。

瘤胃 產(chǎn)甲烷菌 未培養(yǎng)技術 全基因組測序 高通量測序

反芻動物瘤胃中甲烷的生成會造成飼料能量的損失，同時甲烷也是造成溫室效應的主要氣體之一。它對溫室效應的作用是CO2的25倍，全球每年由反芻動物排放的甲烷達8.1×107-9.2×107t，這相當于人類制造的甲烷的23%-27%［1］。產(chǎn)甲烷菌不足瘤胃微生物總量的4%，但幾乎產(chǎn)生了反芻動物釋放的全部甲烷［2］。將產(chǎn)甲烷菌的活性和數(shù)量控制在最適水平，達到反芻動物最佳的生產(chǎn)性能而對環(huán)境不造成影響是目前研究的重要方向。產(chǎn)甲烷菌是嚴格厭氧的古菌，一些在體內(nèi)可以發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)甲烷菌在體外很難分離培養(yǎng)。所以到目前為止，只有很少種類的產(chǎn)甲烷菌從瘤胃中分離出來，已經(jīng)分離培養(yǎng)出來的瘤胃產(chǎn)甲烷菌主要為甲酸甲烷桿菌（Methanobacterium formicicum）、布氏甲烷桿菌（Methanobacterium byantii）、甲烷短桿菌（Methanobrevibacter ruminantium）和可移動的甲烷微菌（Methanomicrobium mobile）［3］。隨著分子生物學的發(fā)展，未培養(yǎng)技術已越來越多地應用到瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究中，通過未培養(yǎng)技術可以不需要產(chǎn)甲烷菌的分離培養(yǎng)就可以準確地研究瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌性質(zhì)。本文主要介紹幾種未培養(yǎng)技術以及其在產(chǎn)甲烷菌研究上的應用。

1 產(chǎn)甲烷菌多樣性

1.1 產(chǎn)甲烷菌的引物

產(chǎn)甲烷菌研究中目的基因主要為16S rDNA和mcrA基因，16S rDNA是編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應的DNA序列，既具有保守性，又具有高變性。保守性能夠反應出生物物種的親緣關系，為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索；高變性則能揭示出生物物種的特征核酸序列。mcrA基因編碼甲基輔酶M還原酶（MCR）的α亞基，甲基輔酶M還原酶是甲烷產(chǎn)生過程中的一種關鍵酶，這種酶將與它的連接的甲基還原為CH4［4］，它是產(chǎn)甲烷菌所獨有的目的基因。16S rDNA的常見引物已在表1中列出，mcrA基因的常見引物已在表2中列出。

1.2 變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）

DGGE技術以DNA指紋圖譜為基礎，利用了DNA分子從雙螺旋型到局部變性時電泳遷移率會急劇下降的原理。在得到的圖譜中每一個條帶都代表著某個微生物優(yōu)勢菌群。

Zhou等［26］以16S rDNA為目的基因利用DGGE研究兩種不同日糧：生長期的日糧（高能量）和育肥期的日糧（低能量）對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的影響。從DGGE的圖譜中發(fā)現(xiàn)，兩種日糧的優(yōu)勢條帶不同，測序發(fā)現(xiàn)低能量日糧主要以Methanobrevibacter ruminantiumNT7為主，而高精料日料含有Methanobrevibacter smithii、Methanobrevibactersp. AbM4和M.ruminantiumNT7。Popova等［34］用高精料日糧和低精料日糧飼喂奶牛，以mcrA基因作為目的基因用DGGE的方法研究產(chǎn)甲烷菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)高精料日糧飼喂的奶牛產(chǎn)甲烷菌的多樣性明顯低于高粗料日糧組，日糧中的細胞壁成分的含量與瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌的多樣性成正比。Monica等［35］利用DGGE觀察馴鹿兩個時期（即馴鹿采食量的高峰期和低谷期）瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性發(fā)現(xiàn)，兩組沒有較大差別，說明采食量不會引起馴鹿瘤胃微生物的多樣性的變化。

Zhou等［36］在奶牛飼糧中添加外源纖維素酶，甲烷生成量增加，為了解外源纖維分解酶對瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性和數(shù)量的影響以及甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷菌群落結構的關系，應用實時定量PCR和DGGE技術，發(fā)現(xiàn)瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量沒有改變，但是瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性發(fā)生了改變。Cheng等［37］用3對引物（344fGC/915r、519f/915rGC和1106fGC/1378r）作DGGE研究中國西部綿羊產(chǎn)甲烷菌的多樣性發(fā)現(xiàn)，引物519f/915rGC產(chǎn)生的條帶分辨率最高。

DGGE直接利用微生物樣品中的DNA或RNA對微生物群體加以區(qū)別，能解決微生物無法進行體外培養(yǎng)的難題，可判斷出微生物間的種屬關系，甚至還可以發(fā)現(xiàn)新的微生物。但是DGGE技術也存在一些缺點，如DNA的分離技術不同，細胞壁的破裂程度不同，DNA的回收率不同以及PCR不均等擴增都會造成試驗結果的不同。此外，當微生物的DNA量不到樣品DNA量的1%時，很難檢測其條帶。有一些產(chǎn)甲烷菌的基因組中含有多個目的基因的拷貝，就會過高的估計產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。

1.3 16S rDNA/mcrA基因建庫

構建16S rDNA/mcrA文庫可以對某一特定環(huán)境中甲烷菌群落結構和多樣性進行分析。用PCR技術擴增特異的產(chǎn)甲烷菌的基因，然后將這種特異的基因與載體連接，轉入大腸桿菌形成文庫，選取陽性克隆測序，在測序的結果中去除載體和嵌合體序列，得到的序列與GenBank/RDP數(shù)據(jù)庫比對，就可以知道每個克隆中的片段屬于那一種微生物。

Franzolin等［38］研究不同粗飼料類型（牧草、玉米秸稈和甘蔗）對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的影響，經(jīng)16S rDNA建庫后，得到467個克隆，包含19個操作分類單元：其中有4個在3個文庫中都存在，8個是特異的，6個存在于玉米秸稈組和牧草組，1個存在于甘蔗組和牧草組，由此發(fā)現(xiàn)不同粗飼料類型會改變瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性。Huang等［39］為了解牦牛甲烷產(chǎn)量少于青藏高原牛的原因，構建牦牛和青藏高原牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌16S rDNA文庫，在牦牛的文庫中發(fā)現(xiàn)了209個克隆，青藏高原牛文庫中205個克隆，將相似度在98%及以上歸為一個操作分類單元，共發(fā)現(xiàn)了95個操作分類單元：牦牛單獨含有46個操作分類單元，青藏高原牛含有34個操作分類單元，在兩個文庫中都存在的操作分類單元有15個。牦牛瘤胃的產(chǎn)甲烷多樣性要高于青藏高原牛。

表1 產(chǎn)甲烷菌16S rDNA引物［5］

表2 產(chǎn)甲烷菌mcrA基因引物［5］

裴彩霞等［40］采用3對特異性引物擴增瘤胃古菌16S rRNA基因分別建立克隆文庫研究晉南牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性，引物Archf364/r1386建立的克隆庫中，克隆分為4類，分別與Methanobrebacter. ap.1Y（61%）、SM9（23%）、NT7（14%）和AK-87（2%）相似。引物1Af/1100Ar建立的克隆庫中，克隆分為兩類，分別與Methanobacterium aarhusense（72%）和Methanosphaera stadtmanaeDSM3091（28%）相似。引物Met86F/Met1340R建立的克隆文庫反映的古菌種類較為全面，除4種甲烷短桿菌（所占比例分別為47%、26%、11%和3%）外，還有Methanomicrobium mobile（2%）、以及類似Methanobacterium aarhusense（1%）和Methanosphaera stadtmanae（3%）的序列，還有7%的未匹配序列。Tymensen等［41］分別利用16S rDNA和mcrA建立文庫研究瘤胃液和附著在原蟲上的產(chǎn)甲烷菌的多樣性，結果表明瘤胃液中產(chǎn)甲烷菌的多樣性要顯著高于附著在原蟲上的產(chǎn)甲烷菌。Hook等［42］通過16S rDNA建庫和DGGE的方法研究莫能菌素對瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，莫能菌素不會影響產(chǎn)甲烷菌的多樣性。

建立基因文庫較為準確，可以精確地了解瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的系統(tǒng)分類。在實際研究中常常與DGGE相結合。但是要得到全面準確的數(shù)據(jù)，就要得到足夠的克隆，挑取克隆的過程和步驟較為繁瑣，測序的費用也相當高。而且即使有相當量的克隆也有可能遺漏一些豐度較低的基因。

1.4 限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術

RFLP（T-RFLP）技術通過檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小以識別限制性片段長度的多態(tài)性。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出末端限制性片段長度多態(tài)性技術等，T-RFLP在技術上與RFLP相似，只是其中的一個引物的5'端用熒光物質(zhì)標記，將PCR產(chǎn)物進行特異的酶切后就產(chǎn)生了許多不同長度的限制性片段，其中帶有熒光標記的目標片段就可以被DNA自動測序儀檢測到。

Frey等［43］為了了解泌乳牛瘤胃、十二指腸、回腸和糞便中產(chǎn)甲烷菌的多樣性，應用RFLP技術研究發(fā)現(xiàn)在4個部位的產(chǎn)甲烷菌多樣性差異不顯著。Danielsson等［44］應用T-RFLP技術和16S rDNA建庫結合研究不同日糧精粗比例對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的影響，發(fā)現(xiàn)日糧精粗比與瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性成反比。

1.5 高通量測序

高通量測序是通過對小亞基核糖體（如16S rRNA）基因高變區(qū)進行測序快速的檢測樣本中產(chǎn)甲烷菌的多樣性。在轉錄組學研究中，RNA-seq直接定量檢測瘤胃產(chǎn)甲烷菌的轉錄出來的mRNA的數(shù)量，從而了解產(chǎn)甲烷菌中代謝所需酶的活性［45，46］。

Fout等［47］利用高通量測序來檢測瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性，得到138個序列，97%相似度序列歸類分析，發(fā)現(xiàn)了20個OTU。其中18個OTU為數(shù)據(jù)庫中已存在的序列，2個OTU為新菌，分別與Methanobrevibacter和Thermogymnomonas最為相似。

Hristov等［48］利用高通量測序檢測日糧中添加不飽和脂肪酸對瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的影響，發(fā)現(xiàn)添加不飽和脂肪酸可以明顯增加Methanosphaera的數(shù)量而減少Methanobrevibacter的數(shù)量。

Lee等［49］研究韓國本地1種羊和3種牛的瘤胃產(chǎn)甲烷菌群落結構，高通量測序發(fā)現(xiàn)在4種動物的體內(nèi)都不存在未知的產(chǎn)甲烷菌，都可以在數(shù)據(jù)庫中找到。

2 產(chǎn)甲烷菌的定量分析

實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，RTPCR）是在PCR的體系中加入熒光標記物后，模板擴增產(chǎn)物的量與熒光信號的強弱成正比，即每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系。利用已知拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線，只要得到未知樣品的CT值，就能算出起始拷貝數(shù)。

Zhou等［25］以16S rDNA為目的基因用3種不同的特異性引物AbM4-F/AbM4-R，Stad-F/Stad-R和uniMet1-F/uniMet1-R分別定量測定Methanobrevibactersp. strain AbM4，M. stadtmanae和Total methanogens來研究日糧消化效率對牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)消化率對總產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量沒有影響，但是高消化率組的Methanosphaera stadtmanae和Methanobrevibactersp. strain AbM4的數(shù)量是低消化組的1.92和2.26倍。Tymensen等［50］利用引物NestmetF/ NestmetR，Nest-MbbF/NestMbbR，NestRCCF/NestRCCR和NestMmF/NestMmR分別擴增總甲烷菌Methanobrevibacterspp.，RCC和Methanomicrobiumspp.來研究與原蟲共生的產(chǎn)甲烷菌，發(fā)現(xiàn)Methanobrevibacterspp.和RCC是與原蟲連接的主要產(chǎn)甲烷菌。Hook等［51］以mcrA基因為目的基因應用實時定量PCR和建庫研究能量高低不同的日糧對奶牛瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌的影響發(fā)現(xiàn)，日糧能量的高低對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的影響不大。Denman等［30］用mcrA基因作實時定量PCR研究溴氯甲烷對瘤胃產(chǎn)甲烷菌的影響發(fā)現(xiàn)，日糧中添加溴氯甲烷可顯著減少瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。David等［52］利用mcrA基因定量總產(chǎn)甲烷菌發(fā)現(xiàn)飼喂干草的綿羊瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌要多于飼喂混合日糧的產(chǎn)甲烷菌。

實時定量PCR技術能夠準確地定量研究瘤胃中產(chǎn)甲烷菌，但是要研究每一種產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量必須得到相應的引物，但因一些產(chǎn)甲烷菌的引物還沒有得到或在PCR過程中效率太低或特異性不好，因此不能定量研究。

3 產(chǎn)甲烷菌基因組

全基因組測序是對未知基因組序列的物種進行個體的基因組測序，從整體上研究微生物的功能和組成。在新西蘭、澳大利亞和韓國正在進行著瘤胃產(chǎn)甲烷菌的基因組測序（表3）。

到目前為止，已有2種產(chǎn)甲烷菌測序完成并公布，第一個為Methanobrevibacter ruminantiumM1［53］，它是由Bryant在1965年分離得到的，全長2.93 Mb。通過全基因組測序在M1的基因組中發(fā)現(xiàn)前噬菌體的基因組、分解酶基因以及內(nèi)異肽酶PeiR基因，這些基因與M1的代謝息息相關。此外，還在M1的基因組中還發(fā)現(xiàn)了非核糖體肽合成酶基因，這是此基因在古菌基因組中第一次發(fā)現(xiàn)，從而揭示一些未知的代謝機理。另一個測序完成的產(chǎn)甲烷菌為Methanobrevibactersp. JHI，它是在韓國土牛瘤胃中分離得到的［54］，通過基因組測序發(fā)現(xiàn)JHI的基因組與Methanobrevibactersp. AbM4（從新西蘭羊皺胃分離，并測序完成，未發(fā)表）相似，說明它們在系統(tǒng)發(fā)育學上屬于同一種類。但是在JHI的基因組中發(fā)現(xiàn)了前噬菌體基因，而AbM4沒有，說明兩者在進化上出現(xiàn)了分支。全基因組測序在JHI的基因組中也發(fā)現(xiàn)了與甲烷生成利用的H2、CO2和甲酸鹽相關的酶。

通過全基因組測序可以清楚地了解目的產(chǎn)甲烷菌的代謝過程和系統(tǒng)發(fā)育的位置。在此基礎之上，應用免疫方法和代謝阻遏物可以控制代謝過程中酶的活性來減少甲烷的排放［55］。但是全基因組測序是一項很大的工程，而且只有分離培養(yǎng)出來的產(chǎn)甲烷菌才能進行全基因組測序，成功分離培養(yǎng)的產(chǎn)甲烷菌只占瘤胃產(chǎn)甲烷菌很小的一部分。

表3 瘤胃產(chǎn)甲烷菌基因組測序計劃［56］

在實際的研究過程中，DGGE技術、16S rDNA/

mcrA基因建庫、RFLP技術以及高通量測序主要用于研究產(chǎn)甲烷菌群落結構，包括菌落的多樣性，豐富度。實時定量PCR主要用于定量產(chǎn)甲烷菌。若要了解產(chǎn)甲烷菌的功能和性質(zhì)則需要全基因組測序。有時，為了更加準確具體地研究產(chǎn)甲烷菌，幾項技術可以同時運用，克服彼此的缺點。如在一些研究中DGGE與16S rDNA/mcrA基因建庫聯(lián)合使用，DGGE可以發(fā)現(xiàn)主要的產(chǎn)甲烷菌，而16S rDNA/mcrA基因建庫可以提高覆蓋率全面地研究菌種的多樣性，兩者相互補充，互相驗證。16S rDNA/mcrA基因建庫與定量PCR的聯(lián)合使用常常用于研究影響產(chǎn)甲烷菌的因素。

4 展望

未培養(yǎng)技術已經(jīng)應用到了很多瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究中。隨著高通量測序的普及，基于高通量測序的多樣性研究是未來的發(fā)展趨勢，全基因組測序也是未來研究產(chǎn)甲烷菌代謝途徑和系統(tǒng)發(fā)育的重要內(nèi)容。利用這些技術可以了解瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的群落結構和生理狀態(tài)，為合理有效控制甲烷的生成提供理論依據(jù)。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Application of Uncultured Methods in the Study of Ruminal Methanogen Population

Wang Xingwen1，2Wang Jiaqi1Zhao Shengguo1Li Fadi2Bu Dengpan1
（1. State Key Laboratory of Animal Science，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100193；2. College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

The ruminal methanogen are strictly anaerobic, which are hard to culture.The ruminal methanogen which have been cultured successfully are only 4 species.while hundreds of species of methanogen could not be cultured.The application and development of uncultured technology promotes the research of ruminal methanogen, which overcome the limitation of the tranditional technology of isolation and culturing. Several dominant culture-independent technologies used to study ruminal methanogens were introduced in this paper to provide

on methods for future ruminal methanogen study.

Rumen Methanogen Uncultured methods Whole genome sequencing High throughput DNA sequencing

2013-09-03

國家自然科學基金項目（31261140365），科技支撐計劃項目（2012BAD12B02），中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目（XDA01010301）

王興文，男，碩士研究生，研究方向：反芻動物營養(yǎng)；E-mail：xing.wen111@163.com

卜登攀，副研究員，碩士生導師，研究方向：反芻動物營養(yǎng)與代謝調(diào)控；E-mail：burdengpan@gmail.com