彭秀娟，馬永能，劉國雄，楊自力，劉　姍，任皓月，賈曙光

(1.綿陽市第三人民醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000；2.綿陽市疾病預(yù)防控制中心，四川綿陽 621000)

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·論著·

HIV感染者CD4+T細(xì)胞數(shù)與IL-10、TNF-α表達(dá)水平的相關(guān)性*

彭秀娟1，馬永能1，劉國雄1，楊自力1，劉姍1，任皓月1，賈曙光2

(1.綿陽市第三人民醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000；2.綿陽市疾病預(yù)防控制中心，四川綿陽 621000)

摘要:目的探討人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者血清白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞水平的相關(guān)性。方法抗HIV抗體初篩試驗、IL-10、TNF-α測定均采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。確證試驗用免疫印跡(WB)法。CD4+T細(xì)胞數(shù)測定采用流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果與健康對照組(NC組)比較，IL-10和TNF-α的水平在HIV感染者或AIDS患者體內(nèi)明顯升高(P<0.05)，而且CD4+T細(xì)胞數(shù)少于3.5×105個/毫升者(A組)較CD4+T細(xì)胞數(shù)不少于3.5×105個/毫升(B組)的升高更為明顯(P<0.05)。結(jié)論由于免疫系統(tǒng)的缺陷，HIV感染者血清IL-10和TNF-α水平增加，而且隨著患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量的減少而增加的程度更高。動態(tài)測定HIV感染者的IL-10和TNF-α水平變化，可作為監(jiān)測患者免疫狀況和病情發(fā)展的參考。

關(guān)鍵詞:人類免疫缺陷病毒；獲得性免疫缺陷綜合征；白細(xì)胞介素-10；腫瘤壞死因子-α

人類免疫缺陷病毒(HIV)感染已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會問題，截至2009年，全球感染HIV的人數(shù)約3 300萬[1]。HIV感染人體后，主要攻擊CD4+T細(xì)胞，隨著疾病的發(fā)展主要表現(xiàn)為免疫激活、CD4+T細(xì)胞的耗竭和免疫缺陷的發(fā)生[2]。T細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子重要的免疫細(xì)胞，而細(xì)胞因子的平衡在免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定中具有重要作用。細(xì)胞因子在體內(nèi)濃度的變化與HIV感染的發(fā)病機(jī)制和獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的發(fā)展過程有關(guān)[3-6]。由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(TNF)-α[5]和Th2細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-10(IL-10)[6]在不同免疫狀況(CD4+T細(xì)胞水平不同)的HIV感染者體內(nèi)的表達(dá)情況是本文探討的重點。由于AIDS是潛伏期較長的慢性傳染病，CD4+T細(xì)胞的消耗使人體逐漸喪失免疫能力，從而導(dǎo)致各種感染性疾病和腫瘤的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前對HIV感染者的免疫狀況的監(jiān)測方法主要是使用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的水平，但昂貴的設(shè)備和較高的實驗要求使其未能在各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展。2012年美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)了HIV的第一個非處方的快速檢測試劑盒[7]。尋找能用于監(jiān)測免疫狀態(tài)的細(xì)胞因子，為AIDS自我監(jiān)測提供更多信息也同樣是目前研究的方向之一。本研究通過對AIDS患者外周血CD4+T細(xì)胞水平和IL-10、TNF-α的表達(dá)情況進(jìn)行檢測并探討它們之間的相關(guān)性，旨在為AIDS患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測提供更多的參考信息。

1資料與方法

1.1一般資料將2013～2014年在本院初篩為HIV陽性并經(jīng)確證試驗確診的患者83例納入本研究，根據(jù)市疾病預(yù)防控制中心測得的CD4+T細(xì)胞水平分成兩組，A組(37例)：CD4+T細(xì)胞不少于3.5×105個/毫升，B組(46例)：CD4+T細(xì)胞少于3.5×105個/毫升。另外，選取30例無任何基礎(chǔ)疾病的健康人作為健康對照組(NC組)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與保存用凝膠分離管于清晨采集患者空腹血液3～5 mL，用于抗體和IL-10、TNF-α的測定，以3 500 r/min離心10 min分離血清，EP管收集血清1 mL，-80 ℃保持備用(-80 ℃冰箱雙人上鎖保管)。HIV抗體初篩及確證按照HIV檢測的流程處理，所有的操作均嚴(yán)格按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范(2009版)》初篩實驗室規(guī)范和廠家說明書的要求進(jìn)行操作，在生物安全柜中進(jìn)行。CD4+T細(xì)胞測定由綿陽市疾病預(yù)防控制中心用EDTA抗凝管采集患者3 mL血液后，立即顛倒混勻，用于流式細(xì)胞儀測定。

1.2.2標(biāo)本檢測抗HIV抗體初篩采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，試劑由珠海麗珠試劑股份有限公司提供；HIV抗體確證和CD4+細(xì)胞計數(shù)由綿陽市疾病控制中心AIDS確認(rèn)實驗室分別經(jīng)蛋白印跡法(WB)和流式細(xì)胞儀檢測。IL-10、TNF-α的檢測采用ELISA，用安圖酶標(biāo)儀測定其吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的濃度值，檢測試劑由上海基免生物技術(shù)有限公司提供，以上所有操作均按相關(guān)實驗技術(shù)產(chǎn)品說明書執(zhí)行。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，組間比較采用單因素方差分析或Tukey′s多重比較檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組間CD4+T細(xì)胞水平的比較A、B、NC組間CD4+T細(xì)胞數(shù)實驗數(shù)據(jù)的比較采用Tukey′s多重比較檢驗，分析發(fā)現(xiàn)NC組與A組(q=17.15，P<0.05)、B組(q=27.85，P<0.05)CD4+T細(xì)胞數(shù)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1　　各組間CD4+ T細(xì)胞水平的比較

圖2　　各組間TNF-α水平的比較

2.2各組間TNF-α、IL-10水平的比較各組間TNF-α的檢測結(jié)果及比較見圖2。NC組與A組，NC組與B組以及A、B兩組間TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。IL-10的檢測結(jié)果及比較見圖3，NC組與A組,NC組與B組以及A、B兩組間IL-10水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖3　　各組間IL-10水平的比較

3討論

AIDS患者因HIV感染而引起CD4+T細(xì)胞減少，最終往往會因反復(fù)機(jī)會性感染、惡性腫瘤等而死亡。AIDS目前尚無法治愈且無有效疫苗，其根本原因在于HIV直接破壞人體免疫系統(tǒng)，使免疫系統(tǒng)不能有效抵抗及清除病毒感染。輔助性T細(xì)胞(Th)1和Th2產(chǎn)生的白細(xì)胞介素失衡是免疫系統(tǒng)對病毒反應(yīng)的基礎(chǔ)，隨著病情的發(fā)展，Th1應(yīng)答被抑制而導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂，抗炎性因子水平的升高使患者抵抗力降低[8-9]。增強(qiáng)免疫系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞的功能對HIV感染的控制具有重要意義，是疫苗及治療的重要目標(biāo)之一。早在1989年，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鼠CD4+Th2細(xì)胞分泌一種物質(zhì),可抑制Th1型細(xì)胞因子如干擾素(IFN)產(chǎn)生,被稱為IL-10。IL-10是一種多效細(xì)胞因子，在炎性和免疫反應(yīng)以及疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。而在HIV感染者的體內(nèi)，尤其在感染的晚期，由于機(jī)體免疫系統(tǒng)被抑制，IL-10的水平可能增高。TNF可分為TNF-α和TNF-β兩種，TNF-α來自單核/巨噬細(xì)胞，是由單核/巨噬細(xì)胞分泌的一種小分子蛋白，在抗腫瘤、促進(jìn)炎癥等方面具有重要生物活性。在病毒復(fù)制方面，TNF還具有類似IFN抗病毒作用，阻止病毒早期蛋白質(zhì)的合成，從而抑制病毒的復(fù)制，具有一定抗病毒作用；另一方面，TNF-α可誘導(dǎo)HIV-1基因在T細(xì)胞中表達(dá)，可能與AIDS發(fā)病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF具有免疫活性，會引起HIV感染者或者AIDS患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群的變化[3，5，10]。促炎因子和抗炎因子表達(dá)被活化，在對免疫系統(tǒng)功能失調(diào)方面有重要作用。本研究的結(jié)果顯示：與NC組比較，在HIV感染者或AIDS患者血清中，IL-10和TNF-α的水平會明顯增加(P<0.01)。同時，由于免疫系統(tǒng)的缺陷，CD4+T細(xì)胞數(shù)的減少(<3.5×105個/毫升)，使IL-10和TNF-α水平的增加更為明顯。

綜上所述，HIV感染后患者機(jī)體可出現(xiàn)多種免疫的異常，動態(tài)檢測IL-10和TNF-α水平，對研究HIV-1感染的致病和免疫機(jī)制以及監(jiān)測病情變化均有重要價值。

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Analysis of the correlation between the expression level of TNF-α，IL-10 and CD4+cells in patients with HIV infection*

PengXiujuan1,MaYongneng1,LiuGuoxiong1,YangZili1,LiuShan1,RenHaoyue1,JiaShuguang2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TheThirdPeople′sHospitalofMianyangCity,Mianyang,Sichuan621000，China;2.CenterforDiseaseControlofMianyangCity,Mianyang,Sichuan621000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between interleukin 10(IL-10),tumor necrosis factor (TNF-α) and serum CD4+ T-lymphocytes cell in people who infected HIV.MethodsThe HIV antibody screening test,IL-10 and TNF-α measurement adopted enzyme-linked immune-sorbent assay(ELISA).The HIV antibody confirm test adopted western blot(WB) and CD4+ cell count determination used flow cytometry.ResultsCompared with the normal control group(NC group),the concentration of TNF-α and IL-10 in patients group have statistically significant difference(P<0.05).Moreover,the extent of the increase in group A(patients with the CD4+ T cell count less than 3.5×105 cells/mL) was higher than that in group B(patients with the CD4+ T cell count no less than 3.5×105 cells/mL).ConclusionDue to the defect of the immune system,the serum concentration of TNF-α and IL-10 in people infected with HIV would increased,and the increase of the concentration could be more significant in patients whose CD4+cell count obviously decrease.This study have shown that dynamic measurement of TNF-α and IL-10 concentration would provide data to konw the patients′ immune status and illness development.

Key words:human immunodeficiency virus；acquired immunodeficiency syndrome;interleukin-10;tumor necrosis factor-α

(收稿日期：2015-12-12)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.027

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1081-03

基金項目：綿陽市科技局基金資助項目(14S-ZC-06)；綿陽市市級基金資助項目(201426、201232)；綿陽市第三人民醫(yī)院基金資助項目(201441)。

作者簡介：彭秀娟，女，主管檢驗技師，主要從事臨床免疫學(xué)與檢驗的研究。