陳小鑫， 王松華， 李東風

(華南師范大學生命科學學院，廣州 510631)

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去勢對成年雄性斑胸草雀HVC-RA突觸可塑性的影響

陳小鑫， 王松華， 李東風*

(華南師范大學生命科學學院，廣州 510631)

摘要：應用在體電生理方法研究了去勢前后成年雄性斑胸草雀發(fā)聲運動通路中HVC-RA 突觸的可塑性變化，進一步探討雄激素在調節(jié)鳴唱行為中的作用和機制.結果表明：低頻刺激可引起 HVC-RA突觸群體峰電位幅度的短時程抑制(Short-term depression, STD)，高頻刺激可引起群體峰電位幅度的長時程抑制(Long-term depression, LTD).而去勢后30 d，鳴曲穩(wěn)定時再給予同樣的條件刺激，發(fā)現(xiàn)無論低頻或高頻刺激，HVC-RA 突觸的短時程抑制和長時程抑制現(xiàn)象同時消失.研究結果顯示：鳴曲穩(wěn)定性可能依賴于HVC-RA通路的突觸可塑性，雄激素在維持鳴曲穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用.

關鍵詞：去勢； HVC-RA突觸； 長時程抑制； 短時程抑制； 成年雄性斑胸草雀; 突觸可塑性

鳴禽是動物界中較罕見的發(fā)聲學習物種之一，其發(fā)聲控制通路明確，與人類具有較高的同源性.其發(fā)聲學習過程與人類的言語學習過程極為相似.對鳥鳴的研究有助于對人類語言及其中樞機制的理解.

鳴禽鳴唱系統(tǒng)中突觸可塑性的研究一直是研究熱點. 突觸可塑性可分為短時程和長時程2種，通過控制一些調節(jié)因素，鳴唱通路中的突觸可塑性可發(fā)生改變.研究表明，雄激素、乙酰膽堿(Ach)、致聾等因素都會影響突觸可塑性[1-3]. 在幼年時期鳴禽的RA回返性側枝突觸可以產(chǎn)生LTD，在幼鳥中埋置睪酮則會誘發(fā)鳴唱提前固化，此時則不能誘導出LTD[1]，而HVC、RA具有雄激素受體，可以預見雄激素對HVC-RA突觸可塑性可以產(chǎn)生影響.

課題組前期研究結果表明，在成年雄性班雄草雀中，用高頻刺激可以誘導出HVC-RA的長時程抑制，低頻刺激可誘導HVC-RA的短時程抑制[4].伴隨著鳴禽習得性發(fā)聲及HVC-RA通路上結構和功能上的發(fā)育，HVC-RA通路的突觸可塑性也隨之變化.鳴禽體內性激素濃度的季節(jié)性變化不僅改變HVC和RA的形態(tài)學特征，也可以通過改變RA 的電生理學特性，進而影響鳴禽的鳴唱行為[5-6].

研究[7]表明，雄激素有穩(wěn)定鳴曲降低可塑性的作用.本實驗室的前期工作[8]已經(jīng)證實，成年雄性斑胸草雀在去勢30 d后血漿中睪酮含量顯著性下降，且主題曲相似性下降，音節(jié)熵值升高.幼年期雄激素會影響鳴唱系統(tǒng)中的RA回返性側枝突觸的突觸可塑性變化，成年雄激素的含量降低后，對斑胸草雀HVC-RA鳴唱運動通路的突觸可塑性產(chǎn)生何種影響呢？本文通過觀察去勢后發(fā)聲運動通路中的突觸可塑性的變化，為闡明雄激素對突觸可塑性和學習記憶的調控機制提供實驗證據(jù).

1材料與方法

1.1材料

斑胸草雀(zebra finch,Taeniopygiaguttata)為年齡大于90 d成年雄性，體質量約12～15 g，購買于廣州花地灣花鳥魚蟲市場.在鳥房中飼養(yǎng)，自然采光，喂食小米和水.分為對照組(7只)和去勢組(9只).

儀器：刺激器 A300(WPI，USA)，放大器DAM70 (WPI，USA)，模數(shù)轉換器ADC42(Pico Technology Limited，UK)， LTP軟件(Version 2.4).刺激電極為外被絕緣漆雙股鎳鉻合金絲，平行距離約0.4 mm.記錄電極為單管玻璃微電極(Sutter Instrument Company，USA)，P-97 微電極拉制器(Sutter Instrument Company，USA)拉制即用，充灌0.5 mol/L的醋酸鈉溶液，電極阻抗為1～6 MΩ，記錄電極通過銀絲與DAM70放大器的記錄線相連.

1.2方法

1.2.1實驗組設置對照組(Sham)：健康成年雄性斑胸草雀進行在體電生理實驗.去勢組(Castration)：去勢手術30 d待鳴曲穩(wěn)定后進行在體電生理實驗.

1.2.2在體細胞外場電位記錄取成年雄性斑胸草雀，胸大肌注射20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉.鳥頭固定與電極的立體定位后進行電生理記錄：記錄電極定位到最佳誘發(fā)反應的位點，應用不同刺激強度(0～2 mA)的配對脈沖進行輸入輸出測試，以確定檢測刺激強度.檢測刺激采用時間間隔為50 ms的配對方波刺激，強度為引起最大誘發(fā)反應1/2～2/3的刺激強度，波寬為0.1 ms，延時20 ms，采樣時間為120 ms，采樣間隔為30 s，誘發(fā)場電位記錄每4次進行疊加平均，利用LTP2.4軟件記錄原始電位圖形. 用檢測刺激穩(wěn)定記錄0.5 h后再開始進行條件刺激的誘導.

突觸可塑性誘導：采用低頻刺激(3 Hz)和高頻刺激(400 Hz)2種.條件刺激后仍采用上述檢測刺激進行檢測，再記錄 1 h.用LTP24進行數(shù)據(jù)記錄.

記錄指標為配對脈沖誘發(fā)的第一個和第二個群體峰電位的幅度，應用WinLTP1.11b軟件進行該指標的離線提取.將數(shù)據(jù)相對于基線進行標準化處理，數(shù)據(jù)用均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，配對t-檢驗計算條件刺激誘導前后的差異性.使用Origin 8.0軟件繪制原始電位圖和統(tǒng)計圖.電生理實驗結束后，切片鏡檢確定記錄電極尖端位置.

2結果與分析

2.1去勢對低頻刺激引起的HVC-RA短時程抑制的影響

2.1.1對照組低頻刺激引起HVC-RA突觸誘發(fā)群體峰電位的短時程抑制低頻刺激誘導下，對于間隔 50 ms 的配對脈沖引起的第1個群體峰電位(圖1A、B)，與誘導前(-2 min)相比，20 min 時電位幅度表現(xiàn)有顯著性減小的趨勢.與誘導前(-2 min)相比，60 min 時電位幅度無顯著性變化(圖1C、D).對于第2個群體峰電位，與誘導前相比，20 min 時電位幅度顯著性減小，60 min 時電位幅度出現(xiàn)降低趨勢，但無顯著性(如圖1E、F).

2.1.2去勢組低頻刺激引起的HVC-RA短時程抑制現(xiàn)象消失去勢后，低頻刺激誘導下，對于間隔 50 ms 的配對脈沖引起的第1個群體峰電位，與誘導前(-2 min)相比，20 min 時電位幅度沒有降低，60 min 時電位幅度也無顯著性變化(圖2C、D).對于第2個群體峰電位，與誘導前相比，20 min 時電位幅度呈現(xiàn)減小的趨勢，沒有顯著性變化，60 min 時電位幅度也無顯著性變化(如圖2E、F).

2.2去勢對高頻刺激引起的HVC-RA長時程抑制的影響

2.2.1對照組高頻刺激引起HVC-RA突觸誘發(fā)群體峰電位的長時程抑制高頻刺激(400 Hz，800脈沖)誘導下，對于間隔 50 ms 的配對脈沖引起的第1個群體峰電位，與誘導前(-2 min)相比，20 min 時電位幅度表現(xiàn)為極顯著性的減小，60 min 時電位幅度均顯著性降低(圖3C、D).對于第2個群體峰電位，與誘導前相比，20 min 和60 min時電位幅度均表現(xiàn)為顯著性地降低(如圖3E、F).

(A)同次實驗中記錄到的配對脈沖引起的第1個和第2個群體峰電位(PS)的幅度變化；(B)圖 A條件刺激前和條件刺激后第 20、 60 min 記錄到的配對脈沖引起的誘發(fā)電位圖；(C)低頻刺激引起的第1個 PS 的幅度變化(n=7)；(D)圖 C 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比；(E)低頻刺激引起的第2個 PS 的幅度變化(n=7)；(F)圖 E 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比.

圖1低頻刺激引起 HVC-RA突觸誘發(fā)群體峰電位的短時程抑制

Figure 1Low frequency stimulation induced short-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS).

(A)同次實驗中記錄到的配對脈沖引起的第1個和第2個群體峰電位(PS)的幅度變化；(B)圖 A條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 記錄到的配對脈沖引起的誘發(fā)電位圖; (C)低頻刺激引起的第1個 PS 的幅度變化(n=9); (D)圖 C 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比；(E)低頻刺激引起的第2個 PS 的幅度變化(n=9)；(F)圖 E 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比.

圖2去勢后低頻刺激對HVC-RA突觸誘發(fā)群體峰電位的短時程抑制現(xiàn)象消失

Figure 2Low frequency stimulation could not induce short-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS) via castration.

(A)同1次實驗記錄到的配對脈沖引起的第1個和第2個群體峰電位(PS)的幅度變化;(B)圖 A 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 記錄到的配對脈沖引起的誘發(fā)電位圖;(C)高頻刺激引起的第1個 PS 的幅度變化 (n=7);(D)圖 C 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比;(E)低頻刺激引起的第2個 PS 的幅度變化(n=7);(F)圖 E 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比.

圖3高頻刺激引起HVC-RA突觸誘發(fā)群體峰電位的長時程抑制

Figure 3High frequency stimulation induced long-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS).

2.2.2去勢組高頻刺激引起HVC-RA長時程抑制消失去勢后，高頻刺激(400 Hz，800脈沖)誘導下，對于間隔 50 ms 的配對脈沖引起的第1個群體峰電位，與誘導前(-2 min)相比，20 min 時電位幅度顯著性減小,60 min 時電位幅度有減小的趨勢但沒有顯著性差異(如圖4C、D).對于第2個群體峰電位，與誘導前相比，20 min和60 min時電位幅度均沒有顯著性的減小(如圖4E、F).

3討論

雄激素對腦的結構和功能具有調節(jié)作用，包括突觸可塑性、學習記憶、認知、情緒、生殖等[9-10].

在哺乳動物中，LTD是小腦運動性學習記憶的細胞突觸模式和神經(jīng)基礎，其本質是通過小腦蒲肯野氏細胞上的AMPA受體及其突觸的長時程抑制(LTD)來完成[11].值得注意的是，從HVC到RA的輸入主要有AMPA和NMDA 2種谷氨酸受體參與[12]，成年后HVC和RA突觸后谷氨酸受體主要是AMPA受體，而脊椎動物的長時程可塑性大多由這2種受體共同參與.鳴禽的運動通路中突觸可塑性的改變也許是由AMPA受體所介導的.有研究表明，LTP負責強化記憶的形成而LTD則選擇核實記憶的內容.當去勢后，由于血漿中雄激素的含量急劇下降限制了LTD的形成，導致無法再核實原本的信息，最終使得鳴曲發(fā)生了不穩(wěn)定的變化.

臨界型鳴禽斑胸草雀成年后，鳴唱結構定型維持不變，去勢會引起成年后鳴禽鳴唱結構的可塑性變化[13].本實驗室前期結果已經(jīng)證實，去勢30 d后鳴曲熵值升高穩(wěn)定性下降，因此以去勢30 d為時間節(jié)點來探討可塑性變化.去勢30 d后發(fā)現(xiàn)相較于正常情況，長時程抑制和短時程抑制現(xiàn)象消失，顯示鳴唱運動通路中的LTD/STD對于鳴曲的維持穩(wěn)定有著重要的作用.

LTP與LTD作為突觸可塑性的2種存在形式，參與了神經(jīng)系統(tǒng)中的學習記憶過程[14].盡管關于LTD的報道遠沒有LTP報道的多，但從神經(jīng)系統(tǒng)的活動規(guī)律來看，要組成一個能學習的完整的神經(jīng)網(wǎng)絡，LTP和LTD都是不可或缺的，其相互影響調控著記憶的形成.如果突觸強度由于LTP而一直增加，一段時間后，所有的突觸效率都會達到一個較高水平，不可能再編碼新的信息.為了使突觸增強成為

(A)同次實驗記錄到的配對脈沖引起的第1個和第2個群體峰電位(PS)的幅度變化；(B)圖A 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 記錄到的配對脈沖引起的誘發(fā)電位圖;(C)高頻刺激引起的第1個 PS 的幅度變化 (n=8)；(D) 圖 C 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比；(E)低頻刺激引起的第2個 PS 的幅度變化(n=8)；(F)圖 E 中條件刺激前和條件刺激后第 20、60 min 數(shù)據(jù)的對比.

圖4去勢后高頻刺激對HVC-RA 突觸誘發(fā)群體峰電位長時程抑制現(xiàn)象消失

Figure 4High frequency stimulation could not induce long-term depression of the amplitudes of evoked population spikes (PS) via castration.

編碼信息的有用機制，必須存在LTD選擇性減弱某些突觸強度，所以LTD的誘導可以使LTP免于過飽和，使記憶保持一定容量，提高相鄰突觸LTP誘導的敏感性，進而提高神經(jīng)網(wǎng)絡重建的精細度和靈活性.

在哺乳類動物當中，小腦一直以來被認作是與運動控制和運動學習有緊密聯(lián)系的腦結構，能快速、準確地完成各種復雜的學習和記憶過程，是有別于海馬腦區(qū)的認知型學習記憶的另一種重要的學習記憶類型，且LTD是小腦運動性學習記憶的細胞突觸模式和神經(jīng)基礎.LTD在運動性學習中起著不斷糾正操作錯誤的作用[15-16].這些結果提示，在鳴禽的鳴唱運動中LTD可能起著類似的作用.HVC-RA中也存在著LTD現(xiàn)象，這與我們實驗室前期的研究結果相一致，本實驗還發(fā)現(xiàn)斑胸草雀去勢30 d鳴曲穩(wěn)定性下降后LTD消失，猜測鳴禽的這種鳴唱運動需要LTD的參與，并且在此過程中LTD通過不斷地糾正錯誤信號來維持鳴曲的穩(wěn)定性.去勢后LTD的消失可能導致某些突觸強度減弱，使編碼信息發(fā)生了紊亂，導致鳴曲的不穩(wěn)定.

近年來，已經(jīng)意識到突觸傳遞的短時程可塑性可能具有重要的生理意義. 短時程突觸可塑性與輸入信號的處理有關，其可能通過突觸前峰電位的時序信息與突觸強度變化的轉換，以助神經(jīng)回路產(chǎn)生可變的輸出信號[17].HVC-RA突觸的傳遞效能有可能通過短時程可塑性將由聽覺信號引起的突觸前峰電位的時序信息轉換為突觸強度的變化，從而產(chǎn)生各種運動指令.由此可見，HVC在鳴曲產(chǎn)生中，尤其是處理鳴曲成分即音節(jié)的時序信息上起著關鍵的作用.

在鳴禽中關于STD的研究并不多見，我們的研究發(fā)現(xiàn)低頻刺激誘導下，可誘發(fā)出HVC-RA通路的短時程抑制，而當去勢30 d鳴曲發(fā)生變化后，短時程抑制的現(xiàn)象消失.提示我們STD的消失可能會使鳴唱行為被削弱.另外，STD被認為與神經(jīng)網(wǎng)絡短時加工有關，而本實驗中STD的消失可能是HVC-RA的神經(jīng)網(wǎng)絡發(fā)生了偏差.

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【中文責編：成文英文責編：李海航】

The Effect of Castration on the Synaptic Plasticity of HVC-RA in Adult Male Zebra Finch (TaeniopygiaGuttata)

CHEN Xiaoxin， WANG Songhua， LI Dongfeng*

(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：Songbirds are animal with the ability of vocal learning like human, and the neural basis of vocal learning is similar to the language learning of human. This study investigated the changes in synaptic plasticity of HVC-RA synapses in adult male zebra finches after castration with in vivo electrophysiology technique, analysed the potential functions and mechanisms of androgen in the process of modulating courtship song and song maintaining. The results showed that low frequency stimulation induced short-term depression, high frequency stimulation induced long-term depression in HVC-RA synapses of adult male zebra finches. When the singing was stable after castration, we found that low or high frequency stimulation could not induce long-term or short-term synaptic depression. These results suggested that the stability of singing may depend on HVC-RA synaptic plasticity, and androgens may play an important role in the song stability.

Key words：castration; HVC-RA synapses; long-term depression; short-term depression; adult male zebra finches; synaptic plasticity

中圖分類號：Q955

文獻標志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)02-0061-06

*通訊作者:李東風，教授，Email: dfliswx@126.com.

基金項目：國家自然科學基金項目(31472002)

收稿日期：2015-07-24《華南師范大學學報(自然科學版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n