陳強(qiáng)，秦姍姍，劉成龍，徐昌水

（南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西南昌330006）

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柚皮苷對gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用*

陳強(qiáng)，秦姍姍，劉成龍，徐昌水

（南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西南昌330006）

摘要：目的探討P2X7受體在HIV-1包膜糖蛋白gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用，以及柚皮苷通過作用于P2X7受體對gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷產(chǎn)生的保護(hù)作用。方法通過gp120處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，并通過MTS比色法檢測細(xì)胞損傷程度和柚皮苷是否對損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）及蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測P2X7受體的表達(dá)變化。結(jié)果gp120處理24 h后，與對照組比較，gp120組細(xì)胞存活率顯著下降（P<0.01）；gp120+柚皮苷組的細(xì)胞存活率與gp120組比較有所上升（P<0.01），但與gp120+BBG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；RT-PCR及Western blot的檢測結(jié)果顯示，gp120組小膠質(zhì)細(xì)胞的P2X7受體mRNA及蛋白均比對照組明顯升高（P<0.01），而gp120+柚皮苷組與gp120組比較有所下降（P<0.01）。結(jié)論P(yáng)2X7受體參與gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷，柚皮苷可能通過抑制P2X7受體的表達(dá)上調(diào)對gp120所致細(xì)胞損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：艾滋病癡呆；BV2小膠質(zhì)細(xì)胞；柚皮苷；gp120；P2X7受體

人類免疫缺陷病毒感染引起的艾滋病腦病，又稱為AIDS癡呆綜合征（AIDS-dementia complex，ADC）[1]，主要臨床表現(xiàn)為患者的學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷，其具體機(jī)制尚不清楚[2]。ADC的病情與免疫抑制程度相關(guān)，其中巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化是ADC發(fā)生的關(guān)鍵[3]，其活化產(chǎn)生的多種有害物質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的其他細(xì)胞產(chǎn)生損害或?qū)е录?xì)胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤2X7（Purinergic 2X7，P2X7）受體在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能活動中具有重要作用，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）作為小膠質(zhì)細(xì)胞功能信號分子，可通過激活P2X7受體活化小膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而釋放炎性因子并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞慢性炎癥反應(yīng)，最終表現(xiàn)神經(jīng)毒性作用[5-6]。結(jié)合P2X7受體涉及炎癥及免疫反應(yīng)，并與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，P2X7受體可能成為ADC防治的新靶點(diǎn)。柚皮苷是一類天然黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、糖脂代謝調(diào)節(jié)和心肌保護(hù)等作用[7]，提示柚皮苷可能對ADC有一定的治療效果。本研究通過建立小膠質(zhì)細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上探究柚皮苷是否對gp120所致小膠質(zhì)細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用，對擴(kuò)寬柚皮苷的應(yīng)用范圍和探索潛在ADC的治療手段等方面具有極其重要意義。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

實驗細(xì)胞：BV2小膠質(zhì)細(xì)胞（GDC0311），由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司），胎牛血清、總RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司），gp120、柚皮苷及亮藍(lán)G（brilliant blue G，BBG）（美國Sigma公司），羊抗兔P2X7抗體（英國Abcam公司），羊抗小鼠β-actin抗體、二抗-羊抗兔IgG、二抗-羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），正反向引物（上海生物工程有限公司），細(xì)胞增殖檢測試劑盒（美國Promega公司），ECL發(fā)光液、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司），NO檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組

以冷凍保存復(fù)蘇后的細(xì)胞為第一代，所用培養(yǎng)基為DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%雙抗），傳代比例為1∶6，3～4 d傳一代，待細(xì)胞傳3 到4代穩(wěn)定后即可用于實驗，所有實驗操作所用的細(xì)胞均控制在30代以內(nèi)。實驗分為對照組、gp120模型組（gp120）、柚皮苷處理組（gp120+柚皮苷）和P2X7受體拮抗劑BBG處理組（gp120+BBG）4組，除對照組外，其余各組均給予2.0 μg/L gp120處理24h，其中g(shù)p120+柚皮苷組和gp120+BBG組分別同時給予柚皮苷（80μm/L）和BBG（50μm/L）處理24 h。接種孔板后，待細(xì)胞生長到70%～80%左右時即可行藥物干擾，其中g(shù)p120用無菌水溶解，柚皮苷用DMSO溶解，BBG用PBS緩沖液溶解，所有藥物用DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋。

1.3MTS比色法測細(xì)胞活性

待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長到80%～90%左右時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。離心后用2 ml DMEM高糖完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。吸取適量體積細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基稀釋，充分混勻后使細(xì)胞密度約為1×105/ml，邊搖晃邊加入到96孔板中，每孔100μl。待細(xì)胞生長到60%左右時更換含有藥物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基處理24 h。MTS儲存液按1∶10的比例用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，處理24 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，每孔加入100μl MTS稀釋液，37℃培養(yǎng)箱（5%二氧化碳CO2）孵育4 h，490 nm檢測每孔的吸光值（absorbance，Abs），各組細(xì)胞存活率以Abs值大小表示。

1.4一氧化氮NO檢測

用24孔板接種細(xì)胞，接種密度約為1×105/ml，每組做3個平行復(fù)孔。加藥處理24 h后，取各組細(xì)胞上清液，根據(jù)一氧化氮NO檢測試劑盒測定各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中的一氧化氮NO含量。結(jié)果通過多功能酶標(biāo)儀讀取Abs值，再根據(jù)試劑盒所給的公式計算得出。

1.5逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）技術(shù)測定P2X7mRNA

表1　P2X7及β-actin mRNA的引物序列

用6孔板接種細(xì)胞，細(xì)胞密度約為1×106/ml。藥物處理24 h后，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞RNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用預(yù)先設(shè)計的正反向引物。見表1。通過RT-PCR法檢測各組P2X7mRNA的表達(dá)情況，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。實驗結(jié)果通過BIO-RAD凝膠成像儀觀察，采用Image Lab凝膠成像系統(tǒng)軟件讀取電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值，與其對應(yīng)的肌動蛋白β-actin條帶的比值作為P2X7mRNA表達(dá)的相對水平量。

1.6蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測P2X7蛋白

藥物處理24 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育一抗（P2X7比例為1∶1 000，4℃孵育過夜；β-actin比例為1∶800，常溫孵育2 h），經(jīng)洗膜后孵育二抗（比例為1∶2 000，常溫孵育1 h），再經(jīng)洗膜后通過BIO-RAD凝膠成像儀曝光顯影。結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0分析軟件讀取目的條帶的光密度值，與其對應(yīng)的β-actin條帶的比值作為P2X7蛋白表達(dá)的相對水平量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實驗中計量資料用單因素方差分析和LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1柚皮苷提高gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率

藥物處理24 h后，各組細(xì)胞通過多功能酶標(biāo)儀讀取Abs值。以Abs值大小代表各組細(xì)胞的存活率，經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F3，24=4.385，P =0.016）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gp120組細(xì)胞存活率與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.002），提示gp120對BV2小膠質(zhì)細(xì)胞有一定的損傷作用；與gp120組比較，gp120+柚皮苷組（P=0.041）和gp120+BBG組（P=0.046）的細(xì)胞存活率有所上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而gp120+柚皮苷組與gp120+ BBG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.962），提示柚皮苷對gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。見表2。

表2　MTS比色法檢測各組細(xì)胞存活率（±s）

表2　MTS比色法檢測各組細(xì)胞存活率（±s）

注：1）與對照組比較，P<0.01；2）與gp120組比較，P<0.05

組別　　樣本數(shù)　Abs值對照組　7　0.91±0.10 gp120組　7　0.71±0.091）gp120+柚皮苷組　7　0.83±0.102）gp120+BBG組　7　0.82±0.122）

2.2BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中一氧化氮NO的含量

通過酶標(biāo)儀讀取各組Abs值后，再根據(jù)一氧化氮NO檢測試劑盒中的公式計算得出各組細(xì)胞上清液中一氧化氮NO的含量，結(jié)果顯示，對照組、gp120組、gp120+柚皮苷組和gp120+BBG組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮NO的含量分別為：（23.15±2.47）、（39.76±3.77）、（27.86±4.60）和（29.93±4.34）μm/L。經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F3，16=9.704，P= 0.005）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gp120組一氧化氮NO含量明顯高于對照組（P=0.001）、gp120+柚皮苷組（P= 0.006）和gp120+BBG組（P=0.015），而gp120+柚皮苷組與gp120+BBG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.532）。見圖1。

2.3柚皮苷抑制gp120所致BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的表達(dá)上調(diào)

各組細(xì)胞提取總RNA后，用RT-PCR法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，對照組、gp120組、gp120+柚皮苷組和gp120+BBG組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的相對表達(dá)量分別為：（0.73±0.06）、（1.05±0.06）、（0.78±0.05）和（0.81±0.04）。經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F3，16=35.478，P=0.000）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gp120組P2X7mRNA的表達(dá)明顯高于對照組（P=0.000），提示gp120能誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的表達(dá)上調(diào)；與gp120組比較，gp120+柚皮苷組（P = 0.000）和gp120+BBG組（P=0.000）的表達(dá)均明顯降低，而gp120+柚皮苷組與gp120+BBG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.480）。該統(tǒng)計結(jié)果提示，柚皮苷能抑制gp120誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的表達(dá)上調(diào)。見圖2。

圖1　各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中一氧化氮NO的含量

2.4柚皮苷降低gp120誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白的表達(dá)上調(diào)

各組細(xì)胞提取總蛋白后，用Western blot方法檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白表達(dá)的相對水平量。結(jié)果顯示，對照組、gp120組、gp120+柚皮苷組和gp120+BBG組P2X7受體蛋白的相對表達(dá)量分別為：（0.46±0.04）、（0.79±0.04）、（0.38±0.07）和（0.42±0.06）。經(jīng)方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F3，16=61.995，P=0.000）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，gp120組P2X7受體蛋白的表達(dá)明顯高于對照組（P=0.000），表明gp120能誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白的表達(dá)上調(diào)；與gp120組比較，gp120+柚皮苷組（P= 0.000）和gp120+BBG組（P=0.000）的表達(dá)均明顯降低，而gp120+柚皮苷組與gp120+BBG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.269），表明柚皮苷對gp120誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白的表達(dá)上調(diào)具有抑制作用。見圖3。

圖2　RT-PCP法檢測各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA的表達(dá)情況

圖3　Western blot法檢測各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7受體蛋白的表達(dá)情況

3　討論

目前，ADC的具體機(jī)制尚不清楚，臨床上也沒有特效的治療藥物[8]。有研究認(rèn)為，HIV或呈游離狀態(tài)或借助感染的免疫細(xì)胞，跨過血腦屏障或血腦脊液屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，間接引起ADC等神經(jīng)退行性疾病[9]。HIV-1包膜糖蛋白gp120在病毒包膜與宿主細(xì)胞表面受體識別與結(jié)合等方面有重要作用[10]，并通過巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和類花生酸類物質(zhì)等神經(jīng)毒素，造成細(xì)胞損傷和干擾神經(jīng)遞質(zhì)功能，進(jìn)而影響到患者的學(xué)習(xí)和記憶能力，引起記憶缺陷[11]。因此，由gp120間接引起的腦內(nèi)巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化在ADC等神經(jīng)退行性疾病中扮演重要角色[12-13]。實驗中發(fā)現(xiàn)，gp120組細(xì)胞存活率明顯低于對照組，表明gp120能夠?qū)V2小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。而gp120+BBG組細(xì)胞存活率與對照組比較無明顯差異，表明P2X7受體在gp120所致細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定的作用，可能因損傷細(xì)胞所釋放出的ATP通過P2X7受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞又以自分泌的形式將ATP刺激信號級聯(lián)放大，從而使小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，使其失去離子選擇性，導(dǎo)致細(xì)胞離子通透性改變，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[14-15]。

P2X7受體在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能活動中具有重要作用[16]。小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)P2X7受體，其生理功能呈多樣性，包括過氧化物和一氧化氮NO的生成、T細(xì)胞的激活和成熟、炎癥因子產(chǎn)生等[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體可通過激活MAPK或其他信號通路，介導(dǎo)細(xì)胞對胞外增殖、分化和死亡等信號的長時程反應(yīng)[18]。實驗結(jié)果顯示，gp120組的P2X7mRNA和受體蛋白表達(dá)均高于對照組，表明gp120能誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞P2X7mRNA和受體蛋白的表達(dá)上調(diào)，提示gp120有可能通過P2X7受體介導(dǎo)的信號通路引起細(xì)胞損傷或死亡。通過細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)，gp120+柚皮苷組的細(xì)胞存活率較gp120組有所上升，說明柚皮苷對gp120所致細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，結(jié)合柚皮苷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等特性，提示柚皮苷可能對HIV引起的ADC有一定的緩解作用。同時，gp120+柚皮苷組和gp120+BBG組的細(xì)胞存活率類似，結(jié)合RT-PCR及Western blot實驗結(jié)果，推測柚皮苷可能在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平抑制gp120誘導(dǎo)的P2X7受體表達(dá)上調(diào)而對細(xì)胞的損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。一氧化氮NO檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除對照組外，其余3組經(jīng)gp120處理的細(xì)胞一氧化氮NO水平均有所上升，與活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一氧化氮NO等有害因子對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用相類似[19]。結(jié)合柚皮苷和BBG對gp120誘導(dǎo)細(xì)胞釋放一氧化氮NO具有類似的抑制作用，推測柚皮苷對gp120所致細(xì)胞損傷產(chǎn)生的保護(hù)作用可能與抑制一氧化氮NO的釋放有關(guān)。

總之，gp120可通過誘導(dǎo)P2X7受體的表達(dá)上調(diào)造成細(xì)胞損傷，柚皮苷對P2X7受體介導(dǎo)的細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。但這種損傷或保護(hù)作用的具體機(jī)制還有待研究，如gp120是否通過P2X7介導(dǎo)的細(xì)胞信號通路呈遞其損傷作用，柚皮苷是否通過參與白介素1β、腫瘤壞死因子α等炎癥因子的調(diào)節(jié)或作用于細(xì)胞信號通路方面來發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用等諸多問題還有待解決。本實驗在細(xì)胞水平上研究ADC等神經(jīng)退行性疾病的可能性機(jī)制，對將來探索ADC的治療手段及新型治療藥物的發(fā)掘等方面具有極其重要意義。

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（張蕾編輯）

論著

Protective effect of naringin on gp120-induced injury in BV2 microglial cells*

Qiang Chen, Shan-shan Qin, Cheng-long Liu, Chang-shui Xu
(Department of Physiology, Basic Medical Sciences College of Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330006, China)

Abstract:Objective To explore the effect of P2X7receptor on HIV-1 envelope glycoprotein gp120 (gp120)-induced injury in BV2 microglial cells, and research the protective effect of naringin on gp120-induced injury mediated by P2X7receptor in BV2 microglial cells. Methods BV2 microglial cell injury model was established by gp120 treatment; The damage degree of BV2 microglial cells and the protective effect of naringin were measured by MTS colorimetry. The expression changes of P2X7receptors were detected by RT-PCR and Western blot. Results Compared with Ctrl group, the cell survival rate of gp120 group decreased significantly after 24-h treatment (P < 0.01). The cell survival rate of gp120 + naringin group increased compared with gp120 group (P < 0.01), while there was no difference compared with gp120 + BBG group (P > 0.05). The results of RT-PCR and Western blot showed that the expression of P2X7mRNA and protein in gp120 group was increased significantly compared with Ctrl group (P < 0.01), and it was decreased in gp120 + naringin group compared with gp120 group (P < 0.01). Conclusions P2X7receptor involved in gp120-induced injury in BV2 microglial cells, and naringin may play a protective effect on gp120-induced injury by inhibiting the up-regulation of P2X7receptor expression.

Keywords:AIDS-Dementia complex; BV2 microglial cells; naringin; gp120; P2X7receptor

[通信作者]徐昌水，E-mail：xuchangshui@ncu.edu.cn；Tel：0791-86360556，13320117233

*基金項目：國家自然科學(xué)基金課題（No：81260187）；江西省青年科學(xué)家（井岡之星）培養(yǎng)對象計劃項目（No：20153BCB23033）；江西省研究生創(chuàng)新專項資金項目（No：YC2015-S040，YC2014-S098）

收稿日期：2015-12-28

文章編號：1005-8982（2016）08-0001-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.001

中圖分類號：R338.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A