王　君，楊雪梅，陳梅妹，陳立武

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院普外科，福建 福州　350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州　350122)

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解毒消癥飲治療胃癌機(jī)制的計(jì)算機(jī)篩選研究

王君1，楊雪梅2，陳梅妹2，陳立武1

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院普外科，福建 福州350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122)

[摘要]目的采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)探討解毒消癥飲治療胃癌的作用機(jī)制。方法先采用分子描述符計(jì)算和主成分分析法研究解毒消癥飲中148個(gè)化合物與32個(gè)抗腫瘤藥物的化學(xué)空間信息分布，探討其類藥性質(zhì)；再通過(guò)分子對(duì)接方法研究解毒消癥飲和腫瘤相關(guān)受體靶標(biāo)如人表皮生長(zhǎng)因子受體家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的相互作用情況，以探討其治療胃癌的分子機(jī)制。結(jié)果解毒消癥飲所含分子與抗腫瘤藥物有類藥性，且更具多樣性；解毒消癥飲中91個(gè)化合物與EGFR、HER-2和COX-2有著顯著的活性抑制作用。結(jié)論解毒消癥飲治療胃癌的作用機(jī)制可能涉及到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及促細(xì)胞凋亡等方面，與胃癌發(fā)病機(jī)制相符合。

[關(guān)鍵詞]解毒消癥飲；胃癌；分子描述符；分子對(duì)接

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，胃癌的發(fā)病率和病死率已顯著下降[1]，但仍舊是全球第四大常見(jiàn)腫瘤，居腫瘤相關(guān)死亡病因的第二位[2]。中國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，年患病率和病死率居高不下，均是世界平均水平的2倍多[3]。人表皮生長(zhǎng)因子受體家族(epidermal growth factor receptor，EGFR；human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)被認(rèn)為與人類腫瘤密切相關(guān)，是胃癌靶向治療的不同靶點(diǎn)基因。

EGFR和HER-2都屬于Ⅰ型酪氨酸激酶受體基因家族，受體的蛋白結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)組成[4]。EGFR與配體結(jié)合后引起受體二聚化及胞漿內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)自身磷酸化并激活酪氨酸激酶的活性，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，如膜受體酪氨酸蛋白激酶信號(hào)傳遞途徑(retrovirus-associated DNA sequences-rapidly accelerated fibrosarcoma-mitogen activated protein kinase，Ras-Raf-MAPK)、酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化因子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)、磷酯酰肌醇-3激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphatidyli nositol 3-kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt)等，參與腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制等基因調(diào)控，在多種腫瘤組織中有高表達(dá)。EGFR在進(jìn)展期胃癌中高度表達(dá)，常伴有EGFR相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào)，提示患者預(yù)后很差[5]。HER-2與EGFR結(jié)構(gòu)相似，有很高的同源序列。在正常情況下處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到體內(nèi)外某些因素作用后，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控失常從而被激活，具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性，最終從多個(gè)途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移和分化等，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[6]。在人類許多上皮源性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中發(fā)現(xiàn)存在有HER-2癌基因的擴(kuò)增及其癌基因蛋白的過(guò)表達(dá)，而且HER-2亦參與腫瘤的形成。HER-2在NCI-N87和4-1ST等胃癌細(xì)胞系中常高表達(dá)。HER-2過(guò)度表達(dá)的惡性腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，預(yù)后較差[4,7]。

COX是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵限速酶，目前已發(fā)現(xiàn)至少有COX-1和COX-2兩種亞型。近年來(lái),大量研究結(jié)果表明,COX-2過(guò)度表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。COX-2的高表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附，抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)加速和侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后變差[10]。

中醫(yī)藥在胃癌的治療中發(fā)揮著獨(dú)特作用，目前許多研究證實(shí)中西醫(yī)結(jié)合治療胃癌可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高遠(yuǎn)期療效。解毒消癥飲是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院用于消化系統(tǒng)腫瘤圍手術(shù)期治療的臨床驗(yàn)方,主要由白花蛇舌草、苦參、夏枯草和山慈姑四味中藥組成(根據(jù)最新臨床研究結(jié)果，去掉原方中鬼針草，新增夏枯草)，該方被臨床證明具有減少?gòu)?fù)發(fā)、延長(zhǎng)患者生存期、提高患者生活質(zhì)量的功效[11]。考慮到復(fù)方制劑成分復(fù)雜，抑制腫瘤生長(zhǎng)的途徑是多方面的，各種具體有效成分尚未明確，本研究將通過(guò)計(jì)算機(jī)藥物虛擬篩選技術(shù)中分子對(duì)接方法來(lái)探討解毒消癥飲治療胃癌的作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床用藥奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1分子化合物的收集和結(jié)構(gòu)優(yōu)化根據(jù)解毒消癥飲中藥組成從《Beilstein/Gmelin CrossFire化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)》《北京大學(xué)中草藥數(shù)據(jù)庫(kù)》《中華本草》《中藥原植物化學(xué)成分手冊(cè)》等國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)收集中藥化學(xué)成分，經(jīng)過(guò)分子結(jié)構(gòu)校對(duì)和排重，得到復(fù)方所含化合物148個(gè)。在分子計(jì)算軟件Discovery Studio 2.0(DS 2.0)的Standalone模塊搭建分子結(jié)構(gòu)，并用Ligand Minimization模塊，選用默克分子力場(chǎng)(merck molecular force field，MMFF)進(jìn)行分子三維結(jié)構(gòu)優(yōu)化。軟件運(yùn)行環(huán)境為DS 2.0圖形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系統(tǒng)。

此外，根據(jù)當(dāng)前抗腫瘤藥物類型收集32個(gè)抗腫瘤藥物，主要涉及烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、鉑類配合物和激素大類，用于分析解毒消癥飲中化合物的抗腫瘤類藥性，并按上述方法進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

1.2分子描述符的計(jì)算分子描述符是連接分子結(jié)構(gòu)和化合物活性的紐帶，是表征化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的參數(shù)，可以揭示分子的空間信息[12]。因此，本研究選取了19個(gè)比較常用的分子描述符進(jìn)行計(jì)算，其中結(jié)構(gòu)描述符包括分子量(molecular weight，MW)、可旋轉(zhuǎn)化學(xué)鍵數(shù)(rotational chemical bond number，nRB)、環(huán)個(gè)數(shù)(ring number，nR)、芳環(huán)個(gè)數(shù)(aromatic ring number，nAR)、氫鍵受體數(shù)(hydrogen bond receptor number，nHAcc)、氫鍵給體數(shù)(hydrogen bond donor number，nHDon)，空間描述符包括分子體積(molecular volume，Vm)、分子表面面積(molecular surface area，SA)、極性表面面積(polar surface area，PSA)、極性表面積分率(fractional polar surface area，F(xiàn)PSA)，拓?fù)涿枋龇╓iener指標(biāo)、Zagreb指標(biāo)、Kappa形狀指標(biāo)(6個(gè))，脂水分配系數(shù)為AlogP98[13]。為了從多維數(shù)據(jù)中提取直觀的信息，本研究運(yùn)用SPSS 19.0對(duì)所計(jì)算的19個(gè)描述符進(jìn)行了主成分分析。

1.3分子對(duì)接

1.3.1受體晶體結(jié)構(gòu)處理從國(guó)際蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)下載EGFR受體、HER-2受體和COX-2酶的三維結(jié)構(gòu)，代碼分別為3W32、3RCD和3LN1。分子對(duì)接前需要進(jìn)行一定處理，即載入charm力場(chǎng)，在此力場(chǎng)下擬合受體大分子的鍵縮能、鍵角彎折能、二面角扭轉(zhuǎn)能、范德華相互作用能、靜電相互作用能等經(jīng)驗(yàn)參數(shù)，然后去除水分子環(huán)境，加上極性氫原子并賦予電荷。

1.3.2分子對(duì)接計(jì)算分子對(duì)接采用DS 2.0中的LigandFit模塊，以蛋白質(zhì)的原配體分子所在位置為結(jié)合位點(diǎn)，半徑為0.5 nm內(nèi)的所有氨基殘基作為結(jié)合位點(diǎn)的活性口袋。計(jì)算蛋白配體相互作用能，采用Dreiding力場(chǎng)打分，柔性對(duì)接，使用蒙特卡羅方法進(jìn)行構(gòu)象采樣，采樣步長(zhǎng)為15 000步，只保留得分最高構(gòu)象。其余參數(shù)使用LigandFit中的缺省值。

1.3.3對(duì)接結(jié)果評(píng)價(jià)LigandFit默認(rèn)采用LigScore1、LigScore2、PLP1、PLP2等打分函數(shù)來(lái)綜合評(píng)價(jià)分子之間相互作用的幾何形狀匹配、能量匹配及化學(xué)環(huán)境匹配。Dockscore是對(duì)接結(jié)果的衡量指標(biāo)，因此，以原配體的Dockscore值及實(shí)驗(yàn)值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選復(fù)方有效抑制成分。

1.3.4運(yùn)行軟件應(yīng)用Accelrys公司的DS 2.0軟件。軟件運(yùn)行環(huán)境：DS 2.0 圖形工作站，Microsoft Windows XP Professional SP2操作系統(tǒng)。本研究在北京大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)室完成。

2結(jié)果

2.1解毒消癥飲中分子化合物的化學(xué)空間信息分析解毒消癥飲中化合物常用分子描述符的統(tǒng)計(jì)值見(jiàn)表1，其中，MW、nHDon、nHAcc和ALogP98的平均值和中位數(shù)均符合口服藥的五大規(guī)則[10]，即MW小于500，nHDon小于5，nHAcc小于10，ALogP98小于5。因此，解毒消癥飲中大部分化合物具有較好的類藥性質(zhì)。圖1為解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的主成分分析示意圖，3個(gè)主成分PC1、PC2和PC3，基本包含了全部指標(biāo)具有的信息，累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)到96%和83%，特征值都大于1。解毒消癥飲中化合物在圖中分布較廣，說(shuō)明其含有的化合物結(jié)構(gòu)具有多樣性，體現(xiàn)了中藥復(fù)方化學(xué)成分多樣性。另外，圖1中解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物在化學(xué)空間分布有較大的重疊，說(shuō)明二者化合物結(jié)構(gòu)具有較大的相似性，又保持各自的特點(diǎn)。

2.2解毒消癥飲中化合物與靶標(biāo)相互作用分析根據(jù)靶標(biāo)晶體復(fù)合物中配體與靶標(biāo)蛋白Dockscore值大小，以100為解毒消癥飲中抗腫瘤顯著活性成分的閾值，共篩選出91個(gè)顯著活性化合物，約占復(fù)方化合物總數(shù)的70%(見(jiàn)表2)。這些活性成分主要來(lái)自苦參、白花蛇舌草和夏枯草3味中藥。表2中靶標(biāo)名稱顯示，苦參、白花蛇舌草分別含有能與3個(gè)靶標(biāo)(EGFR，HER-2和COX-2)有顯著活性作用的化合物，而夏枯草含有與EGFR和HER-2有顯著活性作用化合物，說(shuō)明3味中藥之間相互協(xié)同以增強(qiáng)藥效。從活性化合物個(gè)數(shù)可以得出，苦參是復(fù)方中含有活性成分最多的中藥，說(shuō)明苦參在該復(fù)方中的重要位置。表2的靶標(biāo)功能顯示，解毒消癥飲的作用機(jī)制可能涉及到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及促細(xì)胞凋亡等方面。其中，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移作用主要是通過(guò)抑制EGFR和HER-2來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化進(jìn)程。抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促細(xì)胞凋亡作用主要是通過(guò)抑制COX-2來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝。

表1　解毒消癥飲中化合物常用分子描述符的

注：綠色方形表示解毒消癥飲中化合物，紅色圓形表示抗腫瘤藥物。

圖1解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的

主成分分析示意圖

3討論

解毒消癥飲中化合物分子描述符的統(tǒng)計(jì)值，表明解毒消癥飲中大部分化合物具有較好的口服吸收類藥性質(zhì)。解毒消癥飲中化合物與抗腫瘤藥物的主成分分析示意圖表明解毒消癥飲不僅含有抗腫瘤活性化合物，同時(shí)還含有其他生理活性的化合物。解毒消癥飲虛擬篩選結(jié)果顯示，91個(gè)顯著活性化合物主要來(lái)自苦參、白花蛇舌草和夏枯草3味中藥?？鄥⑹桥R床上常用的抗癌解毒中藥，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，保護(hù)機(jī)體免疫等作用。白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗化學(xué)誘變、抗氧化、抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用，臨床主要用于治療腫瘤和炎性反應(yīng)疾病。夏枯草具有直接抑制腫瘤生長(zhǎng)與增殖作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，是一種常用抗腫瘤中藥。可見(jiàn)，分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果與3味中藥的藥效基本一致。解毒消癥飲與EGFR，HER-2和COX-2都有相互作用，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)、多種途徑、多層次地作用于腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)對(duì)解毒消癥飲相互作用的靶標(biāo)(EGFR，HER-2和COX-2)功能分析，可以推測(cè)解毒消癥飲抗腫瘤作用是通過(guò)多種機(jī)制協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及促細(xì)胞凋亡作用而實(shí)現(xiàn)的，這與惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制相一致。

表2　解毒消癥飲靶標(biāo)的虛擬篩選結(jié)果

結(jié)果表明，解毒消癥飲是通過(guò)抑制EGFR，HER-2和COX-2多靶標(biāo)協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及促細(xì)胞凋亡作用而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，證實(shí)胃癌與EGFR，HER-2和COX-2密切關(guān)系，同時(shí)也揭示白花蛇舌草、苦參和夏枯草3味中藥在復(fù)方中抗腫瘤的重要作用，可有效地防止腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

(衷心感謝北京大學(xué)徐筱杰教授課題組提供的技術(shù)支持與幫助！)

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A Computer-based Virtual Screening Study of Therapeutic Mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction in Treatment of Gastric Cancer

WANGJun1,YANGXue-mei2,CHENMei-mei2,CHENLi-wu1

(1.TheSecondPeople’sHospitalAffiliatedtoFujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350003,China; 2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,FujianFuzhou350122,China)

[Abstract]Objective To explore the therapeutic mechanism of Jiedu Xiaozheng Decoction (JDXZD) in the treatment of gastric cancer using the computer-based virtual screening method. MethodsThe calculation of molecular descriptors and analysis of principal components were used to study the distribution of information on 148 compounds in JDXZD and 32 anticancer drugs in chemical space, and to evaluate the drug-likeness of the compounds in JDXZD. Molecular docking was used to study the interactions between the compounds in JDXZD and tumor-related receptors such as epidermal growth factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2), and cyclooxygenase-2 (COX-2), and to explore the molecular mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer. ResultsThe compounds in JDXZD resembled the anticancer drugs and had a higher diversity than the anticancer drugs. Ninety-one compounds in JDXZD exhibited substantial inhibitory effects on EGFR, HER-2, and COX-2. ConclusionThe therapeutic mechanism of JDXZD in the treatment of gastric cancer might be associated with inhibition of proliferation, invasion, and metastasis of tumor cells and promotion of apoptosis, which is in accord with the pathogenesis of gastric cancer.

[Key words]Jiedu Xiaozheng Decoction; Gastric cancer; Molecular descriptor; Molecular docking

(收稿日期：2015-09-06；編輯：姚實(shí)林)

[中圖分類號(hào)]R735.2；R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.021

通信作者：陳立武，945162540@qq.com

作者簡(jiǎn)介：王君(1976-)，男，碩士，主治醫(yī)師

基金項(xiàng)目：福建省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(wzrk201303)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202646，81503497)；福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015J01340)