張　凱，儲全根，畢華劍，劉新萍，吳元潔，周雪梅，劉德勝，董妍妍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230012)

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抵當湯對糖尿病大鼠心肌組織JAK2/STAT3信號通路的影響

張凱，儲全根，畢華劍，劉新萍，吳元潔，周雪梅，劉德勝，董妍妍

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230012)

[摘要]目的探討抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的影響。方法單次注射鏈脲佐菌素復(fù)制糖尿病大鼠模型，將糖尿病大鼠隨機分為模型組、抵當湯組、桃仁大黃組、水蛭虻蟲組和纈沙坦組，以正常雄性SD大鼠作為正常對照組。正常對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，其余各組大鼠接受相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)8周。采用Western blot法檢測心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)、心肌組織JAK2和STAT3蛋白表達，采用實時熒光定量PCR法檢測JAK2、STAT3 mRNA表達。結(jié)果與正常對照組比較，模型組ANP、JAK2、STAT3蛋白以及JAK2、STAT3 mRNA表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩者的交互作用均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對糖尿病大鼠心肌組織JAK2、STAT3 mRNA表達的交互作用具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。纈沙坦組、抵當湯組及兩個抵當湯拆方組ANP、JAK2蛋白及JAK2 mRNA表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論抵當湯延緩糖尿病大鼠心肌細胞肥大的機制與抑制JAK2/STAT3信號通路有關(guān)，其拆方對JAK2、STAT3 mRNA表達的效應(yīng)存在相互影響。

[關(guān)鍵詞]糖尿病；心肌細胞肥大；抵當湯；JAK2/STAT3信號通路

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是獨立于高血壓及冠狀動脈粥樣硬化，而直接由糖尿病導(dǎo)致心肌損害的一種臨床疾病，是糖尿病的重要并發(fā)癥和主要死因[1]。心肌細胞肥大為其主要病理特征之一。Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(janus activated kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)這一信號通路和心肌細胞肥大的關(guān)系十分密切[2-3]。

抵當湯具有化瘀瀉熱通絡(luò)的功效，符合DCM病變脈絡(luò)瘀阻的病機，臨床及基礎(chǔ)研究中，有較多的用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治[4-6]。在前期研究[7]中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抵當湯能夠顯著抑制糖尿病引起的心肌病變。本研究通過復(fù)制糖尿病模型，應(yīng)用具有化瘀瀉熱通絡(luò)作用的中藥抵當湯及其拆方逐瘀通絡(luò)水蛭虻蟲煎劑、化瘀瀉熱桃仁大黃煎劑對DCM進行早期干預(yù)，以血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ受體阻滯劑纈沙坦為陽性對照藥，觀察各組大鼠心肌組織心鈉素(atrial natriuretic peptide，ANP)水平，以及JAK2、STAT3蛋白及其mRNA的表達水平，探討抵當湯及其兩組拆方對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的干預(yù)作用。

1材料

1.1實驗動物雄性SD大鼠115只，清潔級，體質(zhì)量200～240 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002。

1.2藥物抵當湯方由桃仁25 g，制大黃15 g，水蛭、虻蟲各10 g組成，購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。首次以10倍量水浸泡2 h，煮沸1 h，次煎以8倍量水煮沸1 h，之后合并2次濾液，再以文火濃縮使之含生藥3 g/mL；其后再分別稱取桃仁25 g、制大黃15 g為桃仁大黃組，水蛭、虻蟲各10 g為水蛭虻蟲組，煎煮方法、生藥含量均與抵當湯相同，即得桃仁大黃煎液和水蛭虻蟲煎液。裝瓶后保存于0～4 ℃冰箱。纈沙坦膠囊為北京諾華制藥有限公司產(chǎn)品，批號為國藥準字H20040217，每粒80 mg，使用前用蒸餾水配制成混懸液。

1.3試劑和儀器鏈尿佐菌素(每支100 mg，批號 20130320546)：購自美國Sigma公司；10%水合氯醛(批號 20120210)：購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑(批號 14105)：購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號 00145205)：購自美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀、PikoReal 96熒光定量PCR儀：美國Thermo公司。

2方法

2.1糖尿病模型復(fù)制SD雄性大鼠115只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，其中105只用于糖尿病模型復(fù)制。在實驗前統(tǒng)一檢測所有大鼠血糖，確保每只大鼠血糖值均在3.0～5.0 mmol/L范圍內(nèi)。根據(jù)課題組之前的模型復(fù)制方法[8]，一次性腹腔注射鏈尿佐菌素55 mg/kg，復(fù)制糖尿病大鼠模型，繼續(xù)喂養(yǎng)3周后可出現(xiàn)明顯的糖尿病心肌病變。同時為防止大鼠因血糖值過低而死亡，所有大鼠均給予5%葡萄糖飲水。在模型復(fù)制48 h后，開始給予自來水飲用；72 h后，尾靜脈取血，檢測隨機血糖，以隨機血糖大于16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠模型復(fù)制成功的標準。將模型復(fù)制成功的100只大鼠按體質(zhì)量區(qū)組隨機分為5組：模型組、抵當湯組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和纈沙坦組，每組20只。從剩下的15只血糖水平正常的大鼠中選取10只作為正常對照組。

2.2給藥方法模型復(fù)制成功后第2天開始給予灌胃給藥。將保存?zhèn)溆玫乃悟迪x煎劑、桃仁大黃煎劑、抵當湯煎劑分別用蒸餾水配成1.0 g/mL的3組溶液，各中藥組大鼠均按每日10 mL/kg接受灌胃給藥。纈沙坦組大鼠接受纈沙坦混懸液(每日80 mg/kg)灌胃給藥；正常對照組和模型組大鼠分別接受等容量蒸餾水灌胃。連續(xù)8周。

2.3取材末次灌胃后，將所有大鼠禁食10 h，再稱其體質(zhì)量，用10%水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉，迅速剖開胸腔，取出心臟，剪取左心室心肌組織約0.5 cm×0.5 cm，凍存于-80 ℃冰箱待檢。

2.4Western blot法檢測心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達取大鼠心肌組織，用Trizol試劑提取組織蛋白質(zhì)，用Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量。將提取的等量蛋白質(zhì)加入2倍加樣緩沖液，煮沸10 min后冷卻，上樣到SDS-PAGE加樣孔內(nèi)，垂直電泳，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，滴加稀釋的一抗，TBST洗脫后，滴加二抗，再TBST洗脫，用化學(xué)發(fā)光劑溫浴1 min后曝光、顯影和定影，最后掃描，對條帶灰度進行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.5實時熒光定量PCR法檢測JAK2、STAT3 mRNA表達取凍存的心肌組織，置于離心管中，用Trizol法抽提RNA。取RNA樣品3 μg以oligo(dT)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。引物及內(nèi)參照均由Invitrogen公司合成。目的基因JAK2上游引物：5′-TATACTATGGAAACTTGGAGTGGCC-3′，下游引物：5′-AATGTCCTTTGGTAGAACTGTGATG-3′；Stat3上游引物：5′-GAGGAGGCATTCGGAAAGTATT-3′，下游引物：5′-CAGGTCGTTGGTGTCACACA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。取出上述cDNA反應(yīng)液1 μL作為熒光定量的模板，進行PCR擴增，總反應(yīng)體系10 μL：內(nèi)含2倍SYBR格林混合液5 μL，上游引物10 μmol/L 1 μL，下游引物10 μmol/L 1 μL，模板DNA 1 μL，無水RNA酶2 μL，置于實時熒光儀中進行擴增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察拍照，計算目的基因與內(nèi)參照基因條帶的密度比值，作為目的基因的相對表達水平。

3結(jié)果

3.1模型因素對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達的影響與正常對照組比較，模型組ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1和圖1。

3.2抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響以模型組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和抵當湯組作為實驗組合進行兩因素析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT2的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩個拆方的交互作用均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。結(jié)果提示，水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方均可顯著降低糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3表達水平，尚不能認為水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方對這3種蛋白的表達具有協(xié)同或拮抗作用。

3.3抵當湯及其拆方和纈沙坦對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3蛋白表達水平的影響以水蛭虻蟲組、桃仁大黃組、抵當湯組和纈沙坦組為實驗組合進行單因素方差分析，結(jié)果顯示4組糖尿病大鼠心肌組織ANP和JAK2蛋白表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(ANP：F(3，8)=10.90，P=0.003；JAK2：F(3，8)=8.39，P=0.007)；4組STAT3表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F(3，8)=2.16，P=0.171)。多重比較發(fā)現(xiàn)，纈沙坦對ANP表達的效應(yīng)與抵當湯相當(P>0.05)，而對JAK2表達的效應(yīng)與水蛭虻蟲拆方和桃仁大黃拆方相當(P>0.05)，對STAT3表達的效應(yīng)與抵當湯全方及其拆方均相當(P>0.05)。見表1。

表1　各組糖尿病大鼠ANP、JAK2和STAT3蛋白相對表達水平比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與水蛭虻蟲組比較，◇P<0.05；與桃仁大黃組比較，☆P<0.05；與抵當湯組比較，□P<0.05。

表2　抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織ANP、JAK2和STAT3相對表達水平影響的兩因素析因設(shè)計方差分析

注：A.正常對照組；B.模型組；C.抵當湯組；D.水蛭虻蟲組；E.桃仁大黃組；F.纈沙坦組。

圖1抵當湯及其拆方對ANP、JAK2和STAT3蛋白相對表達的影響(Western blot法)

3.4模型因素對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平的影響與正常對照組相比，模型組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)。見表3。

3.5抵當湯及其拆方對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達水平的影響以模型組、水蛭虻蟲組、桃仁大黃組和抵當湯組作為實驗組合進行兩因素析因設(shè)計的方差分析，結(jié)果顯示水蛭虻蟲拆方對大鼠心肌組織JAK2 mRNA表達水平的主效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，對STAT3 mRNA表達水平的主效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，桃仁大黃拆方對JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平的主效應(yīng)均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩個拆方的交互作用均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。簡單效應(yīng)分析結(jié)果顯示，抵當湯組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平顯著高于桃仁大黃組(P<0.05)，而與水蛭虻蟲組JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.6抵當湯及其拆方和纈沙坦對糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA和STAT3 mRNA相對表達水平的影響以水蛭虻蟲組、桃仁大黃組、抵當湯組和纈沙坦組為實驗組合進行單因素方差分析，結(jié)果顯示4組糖尿病大鼠心肌組織JAK2 mRNA表達水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F(3，8)=48.31，P=0.000)；4組STAT3 mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F(3，8)=3.91，P=0.055)。多重比較發(fā)現(xiàn)，纈沙坦組JAK2 mRNA表達水平顯著低于抵當湯及其拆方組(P<0.05)。見表3。

4討論

本研究觀察了具有化瘀瀉熱通絡(luò)作用的《傷寒論》經(jīng)方抵當湯及其2組拆方——具有化瘀瀉熱作用的桃仁大黃配伍和具有逐瘀通絡(luò)作用的虻蟲水蛭配伍對糖尿病大鼠肥大心肌細胞JAK2/STAT3信號通路的干預(yù)作用。

表3　各組大鼠JAK2 mRNA和STAT3

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與水蛭虻蟲組比較，◇P<0.05；與桃仁大黃組比較，☆P<0.05；與抵當湯組比較，□P<0.05。

ANP是一種由心臟合成、貯存和分泌的活性多肽類激素，其代償性升高，被公認為心肌細胞肥大的特征性指標之一[9]，可作為早期診斷DCM的一項參考指標[10]。Oh YB等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ通過血管緊張素1型受體(receptor, angiotensin, type 1, AT1)抑制內(nèi)源性ANP的分泌。Luchner等[12]研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞肥大發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨ANP不斷升高，然而當心肌細胞肥大受到抑制后，ANP水平亦會相應(yīng)降低。纈沙坦作為Ang Ⅱ受體拮抗劑，通過阻斷Ang Ⅱ與其受體AT1結(jié)合來延緩心肌細胞肥大[13]。本研究中模型組和正常對照組相比，大鼠心肌細胞ANP表達顯著上調(diào)，說明糖尿病時出現(xiàn)心肌細胞肥大的表現(xiàn)，而治療組ANP下調(diào)，說明抵當湯可以預(yù)防心肌細胞肥大的發(fā)生，與纈沙坦的作用相當，但全方的作用優(yōu)于逐瘀通絡(luò)水蛭虻蟲配伍和化瘀瀉熱桃仁大黃配伍。

JAK/STAT信號通路包括JAKs家族和STATs家族，JAKs是一種酪氨酸蛋白激酶，STATs家族是其下游信號分子。當細胞外信號分子與膜受體結(jié)合后，激活胞內(nèi)偶聯(lián)的JAKs激酶，激活后的JAKs又能夠磷酸化受體上的酪氨酸位點，使受體產(chǎn)生與STATs結(jié)合的區(qū)域，從而使STATs磷酸化，形成二聚體，從而將信號由細胞膜向核內(nèi)傳遞[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn),JAK2、STAT3表達異常在心肌細胞肥大的發(fā)病機制中扮演重要角色，具有活血祛瘀的中藥能通過抑制JAK2、STAT3的表達防治心肌細胞肥大。本研究顯示，抵當湯組和纈沙坦組下調(diào)JAK2和STAT3 mRNA及其蛋白的表達，抑制JAK/STAT信號通路，對糖尿病心肌細胞肥大有干預(yù)作用；拆方組作用同樣弱于全方組和纈沙坦組。

綜上，具有化瘀瀉熱通絡(luò)作用的抵當湯抑制心肌細胞肥大與調(diào)控JAK/STAT信號通路，下調(diào)ANP的表達密切相關(guān)，且化瘀瀉熱通絡(luò)的抵當湯作用優(yōu)于僅具有逐瘀通絡(luò)的水蛭虻蟲配伍和化瘀瀉熱的桃仁大黃配伍。說明經(jīng)方的配伍組成有其合理性，對糖尿病心肌細胞肥大的抑制作用來看，化瘀瀉熱通絡(luò)作用綜合起來較之單一作用為優(yōu)。

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Effect of Didang Decoction on Myocardial JAK2/STAT3 Pathway in Diabetic Rats

ZHANGKai,CHUQuan-gen,BIHua-jian,LIUXin-ping,WUYuan-jie,ZHOUXue-mei,LIUDe-sheng,DONGYan-yan

(AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of Didang Decoction and its separated recipes on the JAK2/STAT3 pathway in hypertrophic cardiomyocytes in diabetic rats. MethodsA rat model of diabetes was established with a single injection of streptozotocin (STZ). The diabetic rats were randomly divided into model group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, leech-gadfly group, and valsartan group, and normal male Sprague-Dawley rats were used as normal control group. The rats in the normal control group and model group were given distilled water by gavage, and those in the other groups were given corresponding drugs by gavage for 8 weeks continuously. Western blot was used to measure atrial natriuretic peptide (ANP) level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium, and quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression of JAK2 and STAT3.ResultsCompared with the normal control group, the model group showed significantly upregulated ANP level and protein and mRNA expression of JAK2 and STAT3 (P<0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed significant main effects on ANP level and the protein expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05), but the interaction between the two recipes was not significant (P>0.05). The leech-gadfly recipe and Taoren Dahuang recipe showed a significant interaction in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3 in the myocardium of diabetic rats (P<0.05). The ANP level and the mRNA and protein expression of JAK2 showed significant differences between the valsartan group, Didang Decoction group, Taoren Dahuang group, and leech-gadfly group (P<0.05).ConclusionThe mechanism of action of Didang Decoction in delaying cardiomyocyte hypertrophy in diabetic rats may be related to its inhibitory effect on the JAK2/STAT3 pathway, and the separated recipes of Didang Decoction interact with each other in regulating the mRNA expression of JAK2 and STAT3.

[Key words]Diabetes; Cardiomyocyte hypertrophy; Didang Decoction; JAK/STAT pathway

(收稿日期：2015-09-11；編輯：曹健)

[中圖分類號]R587.1；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.022

通信作者：儲全根，chuquangen@sohu.com

作者簡介：張凱(1979-)，碩士，講師

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81273645)；安徽省自然科學(xué)基金項目(1408085MKL32)