姜紹文　林蘭意　項(xiàng)曉剛　盧捷　王芃　莫瑞東　劉昱含　蔡偉　王暉　謝青

200025　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科

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·論著·

IL-33及其受體ST2在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭小鼠中的表達(dá)及意義

姜紹文林蘭意項(xiàng)曉剛盧捷王芃莫瑞東劉昱含蔡偉王暉謝青

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科

【摘要】目的研究D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠中IL-33及其受體ST2的表達(dá)及意義。方法腹腔注射D-GalN(900 mg/kg)/LPS(10 μg/kg)誘導(dǎo)急性肝衰竭小鼠模型。通過q-PCR、Western印跡、ELISA、免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)IL-33及其受體ST2在不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果急性肝衰竭小鼠肝內(nèi)的IL-33 mRNA水平隨著肝損傷加重不斷增高，肝衰竭時(shí)上升至峰值，D-GalN/LPS誘導(dǎo)后7 h，肝組織表現(xiàn)為明顯壞死。而肝內(nèi)ST2L受體蛋白含量在D-GalN/LPS誘導(dǎo)后3 h，未出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞損傷前已顯著升高，之后不斷下降，到7 h肝衰竭時(shí)其水平降至最低。此外，外周血清中IL-33蛋白水平亦隨時(shí)間持續(xù)升高，在7 h肝衰竭時(shí)達(dá)高峰，與IL-33 mRNA的動(dòng)態(tài)變化相一致。然而血清sST2蛋白水平在0 h和3 h肝細(xì)胞損傷的早期無明顯差異，但在5 h肝細(xì)胞損傷的中期卻顯著升高，之后又顯著降低。免疫組織化學(xué)染色顯示急性肝衰竭小鼠肝內(nèi)IL-33來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝血竇細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)論IL-33及其受體ST2隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化與急性肝衰竭的病情進(jìn)展存在緊密聯(lián)系，提示IL-33/ST2軸參與了急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。

【關(guān)鍵詞】IL-33；ST2L；sST2；急性肝功能衰竭；動(dòng)態(tài)表達(dá)

急性肝功能衰竭是臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群，進(jìn)展迅速，病死率高達(dá)60%以上，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。引起急性肝衰竭最常見的原因包括對(duì)乙酰氨基酚過量、特異性藥物反應(yīng)和肝炎病毒感染[2]。目前急性肝衰竭唯一有效的治療手段仍然是肝移植，但肝源稀缺、費(fèi)用過高等因素極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，及早地闡明急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找到針對(duì)性的治療靶點(diǎn)，有效地阻止病情進(jìn)展惡化，對(duì)于挽救患者生命而言至關(guān)重要。既往研究已證實(shí)，全身性炎性反應(yīng)在急性肝衰竭的發(fā)病過程中發(fā)揮舉足輕重的作用。TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等促炎因子持續(xù)造成肝細(xì)胞損傷，引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭[3, 4]。

IL-33 (Interleukin-33)是IL-1家族的第11個(gè)新成員，又稱IL-1F11[5]。不但可作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子參與基因的表達(dá)調(diào)控，還可作為細(xì)胞因子被分泌到胞外，激活靶細(xì)胞，啟動(dòng)免疫反應(yīng)[6]。研究表明，IL-33參與多種肝臟疾病的發(fā)生過程，包括病毒性肝炎、肝臟纖維化和肝細(xì)胞肝癌[7-9]。然而，關(guān)于IL-33/ST2軸在急性肝衰竭中作用的相關(guān)研究較少。本研究通過觀察急性肝衰竭小鼠模型中IL-33及其受體ST2的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探究IL-33/ST2軸是否參與急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，為其治療尋找新的潛在靶點(diǎn)。

資料和方法

一、動(dòng)物和試劑

Balb/C清潔級(jí)小鼠，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院動(dòng)物房清潔級(jí)環(huán)境中適應(yīng)1周后開始試驗(yàn)。試驗(yàn)前12 h禁食不禁水，給藥后正常進(jìn)食進(jìn)水。

D-GalN和LPS購自美國Sigma公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Taq試劑盒購自日本Takara公司，IL-33和ST2的ELISA試劑盒以及一抗購自美國R&D公司。

二、急性肝衰竭小鼠模型的建立

分別按照D-GalN 900、500、400、300 mg/kg和LPS 10 μg/kg的藥物濃度，給予小鼠腹腔注射，給藥后0、3、5、7 h分別處死6只小鼠，留取血清和肝組織。血清存于-80 ℃，一部分肝組織在液氮速凍后存于-80 ℃冰箱，另一部分肝組織甲醛固定。

三、RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和q-PCR

用TRIzol試劑提取肝組織總RNA，具體操作按照說明書進(jìn)行；測(cè)定總RNA濃度，配制成等濃度RNA溶液。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Taq試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄和q-PCR試驗(yàn)，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。IL-33引物由鉑尚公司合成，上游引物為5′-ATTTCCCCGGCAAAGTTCAG-3′，下游引物為5′-AACGGAGTCTCATGCAGTAGA-3′。

四、免疫印跡試驗(yàn)

肝組織勻漿后離心、取上清，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白樣本，使相同體積溶液內(nèi)含有相同質(zhì)量的蛋白。配制10%的膠，完成蛋白樣品和marker上樣，電泳。再經(jīng)過350 mA電流 70 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中常溫封閉1 h。TBST溶液漂洗，5 min × 3次。ST2一抗(1∶2 000)4℃ 孵育過夜。TBST溶液漂洗同前，抗山羊二抗(1∶5 000，碧云天)常溫孵育1 h。TBST溶液漂洗同前，ECL顯影液顯影，曝光拍照。

五、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

血清原液檢測(cè)IL-33，血清1∶20稀釋檢測(cè)ST2，具體操作嚴(yán)格按照R&D試劑盒說明書進(jìn)行。

六、免疫組織化學(xué)染色

5 μm厚的連續(xù)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸-EDTA修復(fù)液98 ℃抗原修復(fù)30 min，冷卻至室溫，TBST緩沖液浸洗10 min × 3次，3%過氧化氫室溫10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，TBST溶液浸洗同前，0.2%曲拉通室溫5 min，TBST溶液浸洗同前，二抗同源血清封閉30 min，IL-33一抗(1∶100)4 ℃ 孵育過夜，TBST溶液浸洗同前，二抗(1∶200)37 ℃孵育30 min，TBST溶液浸洗同前，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、分色，沖水返藍(lán)，梯度脫水、透明，中性樹脂封片。陰性對(duì)照以PBS緩沖液代替一抗。

結(jié)果

一、D-GalN 900 mg/kg 聯(lián)合LPS 10 μg/kg腹腔注射建立急性肝衰竭小鼠模型

不同劑量組合的D-GalN/LPS腹腔注射后小鼠的24 h生存曲線見圖1a。D-GalN 900 mg/kg 聯(lián)合LPS 10 μg/kg可以誘導(dǎo)高死亡率的小鼠急性肝衰竭，與臨床急性肝衰竭情況較為接近。D-GalN 900 mg/kg 聯(lián)合LPS 10 μg/kg腹腔注射后，分別在0、3、5、7 h時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察小鼠肝臟的轉(zhuǎn)氨酶、肉眼觀和HE染色病理改變。隨著肝損傷的加重，ALT和AST逐漸升高，至7 h達(dá)高峰(圖1b)。從0 h到7 h，小鼠肝臟的體積因淤血逐漸增大，色澤由粉紅色漸變?yōu)榘导t色，5 h肝臟表面出現(xiàn)散在點(diǎn)狀出血點(diǎn)，7 h肝臟表面滿布顆粒狀出血點(diǎn)(圖1c)。肝組織病理HE染色顯示，3 h肝小葉結(jié)構(gòu)健全，部分肝細(xì)胞腫脹或出現(xiàn)空泡變性；5 h部分肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，并出現(xiàn)組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤及顯著的點(diǎn)狀、小片狀壞死，肝血竇內(nèi)開始出現(xiàn)淤血；7 h肝小葉結(jié)構(gòu)完全喪失，肝細(xì)胞大塊壞死，匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤，肝血竇內(nèi)充斥血細(xì)胞或閉塞不通，微循環(huán)障礙嚴(yán)重(圖1D-G)。

注：A為不同劑量組合的D-GalN/LPS注射后小鼠的24 h生存曲線；B為小鼠血清ALT和AST的動(dòng)態(tài)變化；C為小鼠肝臟肉眼觀的動(dòng)態(tài)變化；D-G分別為0、3、5、7 h的小鼠肝組織(HE×400)

圖1D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭建模成功

二、IL-33及其受體ST2在急性肝衰竭小鼠肝內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化

如圖2所示，隨著D-GalN /LPS誘導(dǎo)后肝細(xì)胞損傷的加重，肝內(nèi)IL-33 mRNA水平不斷增高，在7 h肝細(xì)胞出現(xiàn)大塊壞死并已達(dá)到肝衰竭時(shí), 其表達(dá)水平達(dá)到高峰。而肝內(nèi)ST2L受體蛋白含量在D-GalN /LPS誘導(dǎo)后3 h，肝細(xì)胞損傷的早期已經(jīng)顯著升高，之后開始不斷下降，到7 h肝衰竭時(shí)下降至最低水平。

三、IL-33及其受體ST2在急性肝衰竭小鼠外周血清中的動(dòng)態(tài)變化

如圖3所示，外周血清中IL-33蛋白水平隨時(shí)間持續(xù)升高，在7 h肝衰竭時(shí)達(dá)到最高水平，與IL-33 mRNA的動(dòng)態(tài)變化相一致。與此不同的是，血清中ST2蛋白水平在0 h和3 h肝細(xì)胞損傷的早期無明顯差異，但在5 h肝細(xì)胞損傷的中期卻出現(xiàn)顯著的升高，之后又明顯下降。

四、急性肝衰竭小鼠IL-33的肝內(nèi)細(xì)胞來源

免疫組化結(jié)果顯示，健康小鼠肝內(nèi)IL-33主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝血竇細(xì)胞核內(nèi)(圖4a)。肝衰竭小鼠肝臟內(nèi)IL-33的細(xì)胞來源也是這兩種細(xì)胞，定位并未發(fā)生改變(圖4b)。

注：A.肝內(nèi)IL-33 mRNA水平隨時(shí)間逐步升高；B. 肝內(nèi)ST2L蛋白含量在3 h增加明顯，之后逐步減少，至7 h達(dá)最低水平；C. 肝內(nèi)ST2L蛋白Western 印跡對(duì)應(yīng)的灰度直方圖

圖2肝內(nèi)IL-33和ST2L隨病情進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化

注：A. 血清IL-33水平逐漸攀升，至7 h達(dá)最高水平；B. 血清ST2在5 h出現(xiàn)峰值后轉(zhuǎn)而下降

圖3外周血清中IL-33和可溶型sST2蛋白隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜

注：A. 健康小鼠肝內(nèi)IL-33表達(dá)；B. 肝衰竭小鼠肝內(nèi)IL-33表達(dá)

討論

盡管近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，急性肝衰竭患者的預(yù)后得到了一定改善，但目前病死率仍很高，其發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制亦不明確。全身炎性反應(yīng)無疑在急性肝衰竭的發(fā)病過程中扮演至關(guān)重要的角色。IL-33是一種新近發(fā)現(xiàn)的、具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，屬于IL-1超家族。研究證實(shí)，IL-33/ST2軸不僅可誘導(dǎo)Th2型免疫，參與過敏性疾病、纖維化疾病和寄生蟲感染等疾病的發(fā)展過程[8, 10-12]，還可通過促進(jìn)Th1型免疫和CD8+T淋巴細(xì)胞在抗病毒和抗腫瘤免疫中發(fā)揮保護(hù)性作用[9, 13]。本研究通過D-GalN/LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型，發(fā)現(xiàn)IL-33及其受體ST2隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化與急性肝衰竭的病情進(jìn)展存在緊密聯(lián)系，說明IL-33/ST2軸參與了急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程，這或可為急性肝衰竭的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

D-GalN/LPS被廣泛用于急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制以及治療干預(yù)的研究。通過觀察記錄不同劑量組合的D-GalN /LPS腹腔注射后小鼠24 h生存曲線，發(fā)現(xiàn)D-GalN 900 mg/kg 聯(lián)合LPS 10 μg/kg所對(duì)應(yīng)的存活率與臨床情況更為接近。

隨著肝細(xì)胞損傷的不斷加重，小鼠肝內(nèi)IL-33 mRNA含量不斷增高，至7 h肝組織表現(xiàn)為大塊壞死時(shí)上升至峰值。而肝內(nèi)ST2L蛋白在3 h肝細(xì)胞損傷的早期即達(dá)高峰，隨后持續(xù)減少，在7 h肝衰竭時(shí)降至最低。外周血清中IL-33蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化與肝內(nèi)IL-33 mRNA變化相吻合，也隨時(shí)間不斷升高，在7 h達(dá)高峰。血清中ST2蛋白水平在0 h和3 h肝細(xì)胞損傷的早期無明顯差異，但在5 h肝細(xì)胞損傷的中期卻出現(xiàn)明顯升高，之后顯著降低。研究證實(shí)，IL-33有兩種存在形式：IL-33前體和IL-33成熟體，分別位于細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞外。IL-33的受體ST2也至少有兩種亞型：跨模型ST2L與可溶型sST2，前者存在于靶細(xì)胞膜上，后者則存在于外周血清中。隨著肝衰竭病情進(jìn)展，肝細(xì)胞由點(diǎn)狀、小片狀的凋亡、壞死發(fā)展為大面積的凋亡、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)崩塌，大量炎性細(xì)胞浸潤，肝血竇充斥血細(xì)胞或閉塞不通，微循環(huán)障礙嚴(yán)重，因此IL-33前體作為一種警戒素被釋放到細(xì)胞外。隨時(shí)間推移，IL-33的血清水平逐步攀升。而表達(dá)于小鼠肝細(xì)胞膜上的ST2L隨著肝細(xì)胞壞死釋放入血[14]，成為血清中sST2的一部分，所以在5 h肝內(nèi)ST2L開始減少，而sST2水平在5 h出現(xiàn)一次躍升。之后在7 h，肝內(nèi)ST2L進(jìn)一步減少，可溶型sST2下降。這或許與重型肝炎時(shí)出現(xiàn)的“膽酶分離”原理類似，疾病末期肝細(xì)胞大量壞死，肝內(nèi)合成ST2L的能力減弱，而血清中的sST2部分被降解，引起sST2水平的下降。

IL-33在肝臟內(nèi)的細(xì)胞來源可因疾病狀態(tài)的差異而出現(xiàn)不同。肝細(xì)胞肝癌時(shí)，IL-33主要定位于效應(yīng)記憶性CD8+T淋巴細(xì)胞[9]。肝臟纖維化時(shí)，激活的肝星狀細(xì)胞為IL-33的主要細(xì)胞來源[8]。而在Con-A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中，IL-33則定位于肝細(xì)胞核內(nèi)[15]。健康小鼠肝內(nèi)IL-33主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝血竇細(xì)胞核內(nèi)，肝衰竭肝臟內(nèi)IL-33的細(xì)胞來源也是這兩種細(xì)胞，定位并未發(fā)生改變。

在急性肝衰竭的發(fā)展過程中，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成肝細(xì)胞大量凋亡，最終導(dǎo)致多器官功能衰竭。在Con-A誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷中，注射IL-33可下調(diào)TNF-α、IFN-γ和IL-17等促炎因子的血清水平，減輕產(chǎn)生這些細(xì)胞因子的免疫細(xì)胞在肝內(nèi)的浸潤程度，包括CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞[16]。還可抑制促凋亡蛋白caspase-3和BAX的激活，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和p-ERK的表達(dá)，從而緩解肝損傷。IL-33可通過激活NF-κB和p38 MAPK信號(hào)通路，增強(qiáng)Bcl-2和cyclin D1的蛋白表達(dá)，從而在肝臟缺血缺氧損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[14]。肝衰竭時(shí)腸道的屏障功能受到削弱，腸菌移位，引起內(nèi)毒素血癥，形成二次打擊，進(jìn)一步加重了肝衰竭。肝衰竭時(shí)高水平的促炎因子，如TNF-α和IL-6，可誘導(dǎo)sST2的生成[17]。一方面，過表達(dá)的血清sST2已被證明能與巨噬細(xì)胞相結(jié)合，通過下調(diào)Toll樣受體4(TLR4)，抑制促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α等)的表達(dá)和Th1型細(xì)胞反應(yīng)，有助于對(duì)內(nèi)毒素血癥形成耐受[18-19]。另一方面，血清sST2作為一種可溶性誘餌受體，可中和外周游離的IL-33，防止IL-33全身性效應(yīng)的發(fā)生[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，若通過基因改造使IL-33染色質(zhì)錨定結(jié)構(gòu)缺失，小鼠將形成高IL-33血癥，引起多器官嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致致死性炎癥[20]。

綜上所述，IL-33及其受體ST2隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化與急性肝衰竭的病情進(jìn)展間存在緊密的聯(lián)動(dòng)關(guān)系，說明IL-33/ST2軸參與了急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展過程。IL-33/ST2軸有望成為急性肝衰竭臨床治療的潛在靶點(diǎn)，為救治急性肝衰竭患者提供希望。

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(本文編輯：錢燕)

The expression profiles and significance of IL-33 and its receptor ST2 in a murine model of D-GalN/LPS -induced acute liver failure

JIANGShao-wen,LINLan-yi,XIANGXiao-gang,LUJie,WANGFan,MORui-dong,LIUYu-han,CAIWei,WANGHui,XIEQing.DepartmentofInfectiousDisease,RuijinHospitalAffilicatedtoMedicalColledgofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China.

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression profiles and implication of IL-33 and its receptor ST2 in a murine model of acute liver failure (ALF) induced by D-GalN/LPS. MethodsThe ALF murine model was set up by intraperitoneal injection of D-GalN (900 mg/kg)/LPS(10 ug/kg), and confirmed by histopathology and biochemistry. Dynamic expression profiles of IL-33 and its receptor ST2 in ALF murine model were investigated by quantitative polymerase chain reaction (q-PCR), western-blot, enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry at different time points, respectively. ResultsThe murine model of ALF was successfully established by intraperitoneal injection of D-GalN (900 mg/kg)/LPS(10 ug/kg). The mRNA level of intra-hepatic IL-33 continuously increased with the progression of ALF, and reached the peak at 7 h after D-GalN/LPS challenge. Compared to baseline, intra-hepatic ST2L protein level was markedly up-regulated at 3 h, which was before the occurrence of obvious hepatocytes damage. However, it declined later on and fall to the lowest at 7 h. In addition, it was observed that IL-33 protein level in serum was elevated sustainedly over time and reached the highest level at 7 h, which was consistent with its dynamic mRNA changes. In contrast, the serum level of sST2 had no significant differences between 0 h and 3 h at the early stage of liver damage, but showed an obvious rise to climax at 5 h in the medium-term of liver damage, and then was followed by a drastic decline. The immunohistochemistry results confirmed that intra-hepatic IL-33 was mainly located in the nucleus of endothelial cells and sinusoidal cells in ALF mouse liver. ConclusionThe dynamic changes of IL-33 and its receptor ST2 in ALF mice are closely linked with the progression of acute liver failure, suggesting that IL-33/ST2 axis is indeed involved in the process of ALF. This might provide a novel potential target for ALF treatment.

【Key words】IL-33; ST2L; sST2; ALF; Dynamic expression

(收稿日期：2015-12-31)

Corresponding author:XIE-Qing,Email:xieqingrjh@163.com

通信作者：謝青，Email：xieqingrjh@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81171569, 81300316, 81570535)，國家十二五重大專項(xiàng)(2012ZX10002003-003, 2012ZX10002007-002, 2012ZX10002007-003-008)，國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目 (感染病學(xué))，上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)課題(20144329)，上海市學(xué)科帶頭人計(jì)劃(12XD1403600)，中國肝炎防治基金會(huì)王寶恩肝纖維化研究基金項(xiàng)目(CFHPC20131056)。