陳　濠，賈瑞博，范錦琳，陳藝煊，王　瑩，陳紫紅，趙立娜，劉　斌，

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州　350002；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州　350002）

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響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝蛋白質(zhì)提取工藝

陳濠1，賈瑞博1，范錦琳2，陳藝煊1，王瑩1，陳紫紅1，趙立娜2，*劉斌1，2

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州350002；2.國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州350002）

摘要：以靈芝蛋白質(zhì)的提取率為指標，考察液料比（V/W）、時間、溫度及pH值對提取率的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析方法確定靈芝蛋白質(zhì)的最優(yōu)提取工藝。結(jié)果表明，靈芝蛋白質(zhì)最佳提取工藝條件為液料比（V/W）120∶1，溫度50℃，pH值10，時間60 min，沉淀pH值3，在此優(yōu)化工藝下靈芝粗蛋白的實際提取率達39.7％。

關(guān)鍵詞：靈芝蛋白質(zhì)；響應(yīng)面分析法；提取工藝

0　引言

靈芝（Ganoderma lucidum）屬于擔子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、靈芝科，是靈芝屬中分布最廣的物種，因其子實體中含有大量的藥理成分，而被視為極珍貴的藥用真菌[1-2]。靈芝蛋白質(zhì)是除了靈芝多糖和三萜外又一類重要的活性物質(zhì)，由于其具有獨特的免疫原性，故其在免疫調(diào)節(jié)和抗病毒、抗腫瘤病等方面都具有顯著的效果[1]。對靈芝蛋白質(zhì)的提取工藝進行優(yōu)化，探討影響靈芝中粗蛋白提取的因素，利用響應(yīng)面分析法來進行試驗優(yōu)化，從而得到最佳的工藝參數(shù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

靈芝，江西井岡山井祥菌草生態(tài)科技股份有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉（NaOH）、濃鹽酸（HCl），分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司產(chǎn)品。UV- 1600型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；KDC- 40型低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；J- 25I型高速離心機，美國BECKMAN公司產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；FE20型精密pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；FD- 3型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2靈芝粗蛋白的提取工藝

靈芝→堿提→紗布過濾→濾液→酸沉（調(diào)pH值進行蛋白沉淀）→4 500 r/min離心→沉淀→冷凍干燥→靈芝粗蛋白。

1.3靈芝粗蛋白含量的測定靈芝總蛋白的含量采用凱氏定氮法[3]測定，靈芝粗提液蛋白的含量采用考馬斯亮藍法[4]測定。蛋白質(zhì)提取率的計算公式：

1.4靈芝粗蛋白提取的單因素試驗

1.4.1液料比對靈芝粗蛋白提取率的影響

稱取靈芝，分別按液料比（V/W）20∶1，40∶1，60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至8，置于50℃下水浴60 min，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min，25℃下離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，以考察液料比對靈芝粗蛋白提取率的影響。

1.4.2時間對靈芝粗蛋白提取率的影響

稱取靈芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至8，置于50℃下分別水浴20，30，40，50，60，70，80 min，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min，25℃下離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，以考察時間對靈芝粗蛋白提取率的影響。

1.4.3溫度對靈芝粗蛋白提取率的影響

稱取靈芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至8，分別置于25，35，45，55，65，75，85℃下水浴60 min，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min，25℃下離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，以考察溫度對靈芝粗蛋白提取率的影響。

1.4.4 pH值對靈芝粗蛋白提取率的影響

稱取靈芝，按液料比（V/W）80∶1加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值分別為7，8，9，10，11，置于50℃下水浴60 min，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min，25℃下離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮藍測定蛋白含量，以考察pH值對靈芝粗蛋白提取率的影響。

1.5響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box- Behnken試驗設(shè)計原理及單因素試驗確定需要的各因素水平范圍，選取pH值、時間、溫度和液料比4個因素各3個水平共29個試驗點進行響應(yīng)面分析試驗。零點試驗重復5次，用以提高試驗誤差估計的靈敏度和準確度[5]。

響應(yīng)面因素與水平設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面因素與水平設(shè)計

1.6靈芝粗蛋白沉淀的pH值范圍確定

取蛋白提取液，用1 mol/L的HCl調(diào)pH值分別為2，3，4，5，6，靜置30 min后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，取沉淀冷凍干燥。

2結(jié)果與討論

2.1靈芝總蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法測得靈芝總蛋白含量為12.07％。

2.2牛血清白蛋白標準曲線的繪制

參考文獻[4]，以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標、以吸光度為縱坐標，繪制出標準曲線，得回歸方程為Y=0.000 7X+0.041 6（R2=0.999 8），線性關(guān)系良好。

2.3單因素試驗

2.3.1液料比對靈芝粗蛋白提取率的影響

液料比對靈芝粗蛋白提取率的影響見圖1。

圖1　液料比對靈芝粗蛋白提取率的影響

由圖1可知，在液料比40∶1～120∶1，靈芝粗蛋白提取率隨液料比的增大而增大；在液料比為120∶1時，提取率達到最大值；之后隨著液料比的增大，提取率無顯著性增加?？紤]到經(jīng)濟成本及后續(xù)試驗的處理過程，本試驗選擇液料比120∶1為最佳液料比。

2.3.2時間對靈芝粗蛋白提取率的影響

時間對靈芝粗蛋白提取率的影響見圖2。

圖2　時間對靈芝粗蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著時間的增加，靈芝粗蛋白提取率也隨之增加，當時間達到50 min之后，提取率隨著時間的增加而下降，此結(jié)論與劉永等人[6]的研究結(jié)果一致。這可能是因為時間變長，溶液的黏度變大，分子的運動速率減慢，阻止蛋白溶解到溶液中去，從而使提取率下降，并且也會增加非蛋白成分與蛋白共沉淀的機會[6]。因此，確定時間為50 min。

2.3.3溫度對靈芝粗蛋白提取率的影響

溫度對靈芝粗蛋白提取率的影響見圖3。

由圖3可知，隨著溫度的升高，靈芝粗蛋白提取率也隨之增大；但溫度升高到65℃之后，再繼續(xù)上升，靈芝粗蛋白提取率反而下降。這可能是由于溫度升高有利于蛋白的溶解，但溫度過高使蛋白質(zhì)的疏水基團暴露和展開，蛋白質(zhì)分子聚集，溶解度下降，導致蛋白質(zhì)提取率下降。所以，確定溫度為65℃。

圖3　溫度對靈芝粗蛋白提取率的影響

2.3.4 pH值對靈芝粗蛋白提取率的影響

pH值對靈芝粗蛋白提取率的影響見圖4。

圖4　pH值對靈芝粗蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著pH值的增大，靈芝粗蛋白的提取率不斷地增大；但當pH值大于10時，提取率反而呈現(xiàn)出下降的趨勢。這是因為pH值過高會引起蛋白質(zhì)發(fā)生分解或者變性等不良反應(yīng)。J S Hamada等人建議，進行可溶性蛋白提取時pH值最好低于9，否則會影響蛋白質(zhì)商用品質(zhì)。因此，確定pH值為9。

2.4響應(yīng)面分析法優(yōu)化靈芝粗蛋白的提取工藝

2.4.1數(shù)學模型的建立及顯著性檢驗

靈芝粗蛋白提取響應(yīng)面分析及結(jié)果見表2。

表2　靈芝粗蛋白提取響應(yīng)面分析及結(jié)果

運用Design- Expert軟件對表2的29個試驗點響應(yīng)值進行回歸分析，以靈芝粗蛋白提取率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬和后，各試驗因素對響應(yīng)值的影響可通過如下回歸方程表示：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3　回歸方程的方差分析結(jié)果

對于提取率來說，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.957 8），該方程是高度顯著的，說明響應(yīng)值的變化有95.78％來源于所選變量，即液料比、pH值、溫度、時間，因此該回歸方程對試驗擬合情況較好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系。若p＜0.05方程是顯著的，則由表3方差分析表可知，A，B，C，D，AB，AC，AD，BC，BD項的影響是顯著的，影響因素的順序為時間＞液料比＞pH值＞溫度。其回歸方程的各項方差分析結(jié)果表明，對于一次項來說，時間和液料比是影響靈芝粗蛋白提取率的主要因素；對于二次項來說，CD是由單因素中的顯著因素變成不顯著因素，因此各試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

2.4.2響應(yīng)面試驗分析及提取工藝的優(yōu)化

各因素的交互作用影響見圖5。

圖5　各因素的交互作用影響

利用Design- Expert軟件對回歸方程進行統(tǒng)計分析，在保持其他因素不變的條件下，將回歸模型進行降維處理分析，以考察因素間的交互作用對靈芝粗蛋白提取率的影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)值存在最大值，各參數(shù)間的等高線呈橢圓形，相互作用顯著，而且能清晰地看到最高點。說明時間、pH值、溫度、液料比相互作用顯著。

利用Design- Expert軟件由所建的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出提取最高靈芝粗蛋白含量的參數(shù)條件為液料比127.22∶1，溫度52.56℃，時間59.37 min，pH值10.05；此優(yōu)化工藝下，靈芝蛋白提取率的預測值為41.4％。為適合試驗操作，調(diào)整條件為液料比120∶1，溫度50℃，時間60 min，pH 值10。對試驗進行驗證得靈芝粗蛋白提取率為39.7％，該回歸方程可應(yīng)用于實踐。

2.5沉淀粗蛋白的pH值范圍

考慮到靈芝粗蛋白的制備，以調(diào)節(jié)pH值沉淀法作為沉淀靈芝粗蛋白的方法。

不同pH值對靈芝粗蛋白沉淀率的影響見圖6。

由圖6可知，pH值在3.0左右時，蛋白沉淀量變化很小，且在較高水平。隨著pH值的增大，沉淀量減少；當pH調(diào)至5時，幾乎無沉淀析出。因此，選擇pH值為3。在此條件下，靈芝蛋白的沉淀率為88.59％。

3　結(jié)論

利用軟件由所建的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)分析，得出提取最高靈芝粗蛋白含量的參數(shù)條件為液料比127.22∶1，溫度52.56℃，時間59.37 min，pH值10.05，沉淀pH值3。在此優(yōu)化工藝條件下，靈芝粗蛋白提取率的預測值為41.4％。

為適合試驗操作，調(diào)整條件為液料比120∶1，溫度50℃，時間60 min，pH值100，沉淀pH值3，對試驗進行驗證得到靈芝粗蛋白質(zhì)提取率為39.7％，通過驗證試驗所得實際值與模型預測值較為接近，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝粗蛋白提取是準確可行的，并為靈芝粗蛋白的進一步研究提供理論依據(jù)。

[1]周選圍，林娟，李奇璋，等.靈芝蛋白類活性成分的研

圖6　不同pH值對靈芝粗蛋白沉淀率的影響

究進展[J] .天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007（19）：917-924.

[2]黃生權(quán)，敖宏，曾凡逵，等.靈芝蛋白酶解產(chǎn)物分析及其抗氧化活性的研究[J] .現(xiàn)代食品科技，2013，29（1）：24-28.

[3]張永華.食品分析[M] .北京：中國輕工業(yè)出版社，2007：214-217.

[4]王孝平，邢樹禮.考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究[J] .天津化工，2009，23（3）：40-42.

[5]劉海彬，張煒，陳元濤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化泡沫分離桑葉蛋白工藝[J] .食品科學，2015，36（8）：97-102.

[6]劉永，梁春侶.蛋清蛋白成分分析與提取工藝優(yōu)化的研究[J] .糧油加工，2010（9）：123-125.

Response Surface Optimization of Protein Extraction from Ganoderma Lucidum

CHEN Hao1，JIA Ruibo1，F(xiàn)AN Jinlin1，2，CHEN Yixuan1，WANG Ying1，CHEN Zihong1，ZHAO Li'na2，*Liu Bin1，2
（1. College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China；2. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：The protein extraction rate is taken as index to study the effect of ratio of material：liquid- material ratio（V/W），extraction time，temperature and pH on extraction yield. On the basis of single factor experiments，the optimized protein extraction process is analyzed by response surface method. The results show that the optimal Ganoderma lucidum protein extraction conditions are as follows：liquid- material ratio（V/W）of 120∶1，extraction temperature of 50℃，pH of 10，extraction time of 60 min，and precipitation pH of 3. And the real extraction ratio obtained by these optimized conditions is 39.7％.

Key words：Ganoderma lucidum protein；response surface analysis；extraction process

*通訊作者：劉斌（1969—），男，博士，教授，研究方向為食品生物技術(shù)。

作者簡介：陳濠（1991—），男，在讀碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（31501432）。

收稿日期：2016- 01- 13

文章編號：1671- 9646（2016）03a- 0033- 04

中圖分類號：TQ464.7

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.009