王　宏，范永鴻，韓鴻紅，潘夏鑫，翁亞軍，黃　楠

(1. 西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031；

2. 西南交通大學 材料科學與工程學院，材料先進技術教育部重點實驗室， 成都 610031)

?

胱氨酸鈉改性TiO2薄膜及其抗血小板激活行為研究*

王宏1,2，范永鴻2，韓鴻紅2，潘夏鑫2，翁亞軍2，黃楠2

(1. 西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610031；

2. 西南交通大學 材料科學與工程學院，材料先進技術教育部重點實驗室， 成都 610031)

摘要：生物材料表面固定催化活性分子，催化內源性供體釋放一氧化氮(NO)，能顯著改善材料表面的血液相容性。通過聚多巴胺作為中間連接層，在TiO2薄膜表面固定不同手性的L-型或D-型胱氨酸鈉獲得催化活性表面，研究固定不同手性胱氨酸鈉表面對改善血小板激活行為的影響。X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)和水接觸角檢測結果顯示，在相同工藝條件下表面固定L-型或D-型胱氨酸鈉后物理化學性質相近，而兩種表面的生物學性質卻存在較大差異，固定D-型表面預先吸附白蛋白后表面親水性略有增加但標準偏差較大，而固定L-型表面催化釋放NO的能力和抗血小板的激活性能均優(yōu)于固定D-型表面。

關鍵詞：TiO2薄膜；胱氨酸鈉；手性；NO；血小板激活

0引言

無機TiO2薄膜具有抑制有毒金屬離子釋放和較好的抗凝血惰性等優(yōu)點，在心血管材料表面改性研究領域引起了廣泛的關注[1-2]。研究顯示，通過進一步在TiO2薄膜表面接枝生物活性功能分子，可以顯著提高其抗凝血性能或細胞相容性[3-4]。

一氧化氮(NO)是內皮細胞分泌的重要信號分子，釋放NO的生物材料顯示出優(yōu)異的抗凝血和抗平滑肌增生性能。其中NO催化釋放型材料將催化活性成分固定在材料表面，當與人體血漿接觸時，由于人體中存在穩(wěn)定的內源性NO供體，將催化產(chǎn)生NO[5-7]。例如，將含有二硫鍵的小分子胱胺固定在TiO2薄膜能夠催化釋放內源性NO供體釋放NO，顯著改善表面的抗血小板激活和粘附性能[8-10]。這類材料不受NO儲存量的限制，具有較大的應用前景。本文選擇胱氨酸鈉作為催化活性分子，通過聚多巴胺作為中間連接層[11]將其固定在TiO2薄膜表面構建表面催化活性,原位催化內源性供體釋放NO。

由于胱氨酸鈉是手性分子，固定L-型和D-型胱氨酸鈉的表面可能具有不同的生物學性能。生物體系中的蛋白質、糖類均具有手性特征，在藥學研究領域已經(jīng)證實不同手性特征的藥物其生物學效能往往大不相同[12-13]。生物材料研究領域的研究結果也同樣顯示，表面成分相同，物理化學性質相似的表面，由于表面手性構型不同，顯示出了不同的蛋白吸附能力和細胞相容性[14-15]，因此本文擬開展固定L-型和D-型胱氨酸鈉TiO2薄膜的抗血小板激活行為研究。

1實驗

1.1胱氨酸鈉改性TiO2薄膜的制備

采用UBMS450高真空非平衡磁控濺射設備，在單晶硅表面沉積TiO2薄膜，所制備的TiO2薄膜為銳鈦礦晶型結構，標記為Ti-O。配制pH值=8.5的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液，加適量多巴胺溶解后使其濃度為2 mg/mL。37 ℃條件下將TiO2薄膜樣品浸入上述多巴胺溶液中24 h，用蒸餾水超聲清洗后得到沉積1層聚多巴胺的樣品，重復上述操作4次得到沉積5層聚多巴胺層的樣品，標記為Dop。配制6 mmol/L 的NaOH溶液，用此NaOH溶液分別溶解L-胱氨酸、D-胱氨酸(購自Sigma-aldrich公司)后制得終濃度為3 mmol/L的L-胱氨酸鈉和D-胱氨酸鈉溶液。將樣品Dop分別浸泡在上述L-胱氨酸鈉和D-胱氨酸鈉溶液中反應24 h，清洗后得到表面接枝了L-胱氨酸鈉或D-胱氨酸鈉的樣品，分別標記為L、D。

1.2XPS分析

XSAM800型X射線光電子能譜儀(英國KRATOS),分析條件為單色AlKα，工作電壓10～20 kV，發(fā)射電流45 mA，光子能量為1 486.6 eV，以C1s(結合能EB=284.6 eV)校正結合能值。

1.3水接觸角分析

用躺滴法測量樣品表面的水接觸角，測試儀器為DSA100型接觸角測量儀(KRüSS, Germany)，結果為12個測試點的平均值。

表面吸附白蛋白后水接觸角檢測方法：配置0.5 mg/mL白蛋白溶液，將樣品L、D分別浸入上述溶液中浸泡2 h，取出用蒸餾水清洗，真空干燥后用DSA100型接觸角測量儀檢測表面的親水性。

1.4催化釋放NO檢測

采用Sievers 280i型NO化學發(fā)光檢測儀(美國)檢測樣品催化釋放NO。檢測條件：N2作為載氣，溫度37 ℃，壓強1 399.88 Pa，內源性供體溶液中GSH濃度為30 μmol/L，GSNO濃度為32.5 μmol/L，實驗樣品大小為0.8 cm×0.4 cm。

實驗方法：將樣品用細絲懸掛在玻璃反應器中，向反應器中加入內源性供體溶液，待基線穩(wěn)定后將樣品完全浸入溶液中,反應生成的NO通過N2氣帶入檢測器進行檢測。

1.5體外血小板粘附實驗

由于體外實驗會不斷消耗內源性供體，而不能像體內那樣自動補充，因此體外血小板實驗時采取了添加內源性NO供體GSNO和GSH的方法。將樣品置于24孔培養(yǎng)板中，每個樣品上加入0.5 mL包含內源性供體的PRP，使內源性供體中GSNO濃度為65 μmol/L，GSH為30 μmol/L，37 ℃恒溫水浴中避光孵化30 min。實驗分為膠原組和非膠原組，膠原組中每個樣品所在的24孔板中加入了膠原，其終濃度為0.06 mg/mL。

粘附血小板的熒光染色：用PBS清洗血小板粘附實驗后的樣品3次，避光條件下向每個樣品表面滴加50 μL羅丹明熒光染料， 37 ℃避光保溫15 min，然后用PBS洗去多余的熒光染料，晾干后用Leica熒光顯微鏡(Leica,Germany)進行拍照觀察。

2結果與討論

2.1XPS分析

圖1所示為L-胱氨酸鈉改性樣品各層次的XPS檢測結果。

圖1固定L-胱氨酸鈉各層次樣品表面不同修飾層XPS圖譜

Fig 1 XPS spectra of samples of each step modified by L-cystine (sodium salt)

從圖1可知，相對于Ti-O樣品，Dop樣品表面出現(xiàn)了N1s的峰，說明多巴胺成功引入到氧化鈦薄膜表面，而L樣品表面相對Dop樣品新出現(xiàn)了S2s(229 eV)和S2p(165 eV)峰，說明L-胱氨酸鈉成功接枝到樣品表面。固定D-胱氨酸鈉系列樣品的XPS全譜與L系列樣品相似，因此不再贅述。

圖2為固定不同手性胱氨酸鈉樣品上S元素的XPS高分辨圖譜。通過樣品L和D表面N、O、C和S各元素高分辨譜的峰面積積分和靈敏度因子，計算出樣品L和D表面S元素的含量分別為1.4%和1.3%，表明在樣品L和D表面固定的不同手性的胱氨酸鈉含量幾乎一致。

圖2　樣品L、D表面的S高分辨圖譜

Fig 2 High resolution XPS spectra of sample L and sample D

2.2水接觸角分析

圖3為各樣品的水接觸角結果。樣品上引入聚多巴胺后表面的水接觸角明顯降低，可能是聚多巴胺中含有大量的親水性基團氨基和醌基的緣故。固定L-胱氨酸鈉與D-胱氨酸鈉樣品表面的親水性沒有差別，然而吸附白蛋白后，兩種表面的親疏水性出現(xiàn)了明顯的差別，D樣品表面的親水性略有增加，但多次實驗結果顯示D樣品表面水接觸角的標準偏差較大，說明D樣品吸附白蛋白后表面的親疏水性很不均勻，可能是D樣品上吸附白蛋白的親水區(qū)域和疏水區(qū)域暴露不均一所造成，深入的機制還需要進一步的研究。

圖3　各樣品的水接觸角

2.3催化釋放NO檢測

化學發(fā)光方法檢測NO釋放的結果如圖4所示。

圖4樣品L、D催化釋放NO檢測結果

Fig 4 Results of NO release catalyzed by sample L and sample D

待基線穩(wěn)定后將樣品浸入供體溶液中，結果顯示固定了胱氨酸鈉的樣品均具有催化釋放NO的功能。NO平穩(wěn)釋放，沒有突釋，圖4中出現(xiàn)的尖峰是由拉下懸掛的樣品時所造成的氣體擾動所致。在供體溶液濃度和測試樣品大小完全一致的條件下，結果顯示L-型樣品催化釋放NO的速度明顯增加。

2.4體外血小板粘附結果

膠原是血小板的激活劑，心血管器械在植入過程中難免會損傷內膜，暴露出下層膠原，因此本文考查了在膠原存在條件下，各樣品表面血小板的粘附情況。結果如圖5所示，膠原存在時表面粘附的血小板完全攤開，內容物釋放，血小板激活程度最高，聚多巴胺表面由于具有醌基，因此具有一定的催化釋放NO功能[16]，其表面的血小板激活其次，樣品L表面血小板的激活程度最低，血小板鋪展最小。

圖5　樣品表面血小板粘附后的照片(膠原組)

未加膠原組血小板粘附后的照片(圖6)也清楚地顯示L樣品表面粘附血小板的激活程度明顯優(yōu)于D樣品上血小板的情況。

圖6　樣品表面體外血小板粘附后的照片(無膠原組)

3結論

(1)通過多巴胺過渡層成功將目標分子胱氨酸鈉固定到TiO2薄膜表面，固定不同手性胱氨酸鈉的表面S元素含量，表面親水性相似，但預吸附白蛋白后表面的親疏水性表現(xiàn)出明顯不同，D-表面親水性略有增加但不均勻。

(2)固定胱氨酸鈉的表面能夠催化內源性供體GSNO釋放NO，而固定L型胱氨酸鈉的表面相對D-型表面具有更大的催化活性。

(3)固定胱氨酸鈉的樣品通過催化釋放NO，顯著抑制了膠原對血小板的激活，固定L-胱氨酸鈉的樣品具有更強的抑制血小板激活功能。

參考文獻：

[1]Liu H, Leng Y, Huang N. Corrosion resistance of Ti-O film modified 316L stainless steel coronary stents In vitro[J]. Journal of Materials Engineering & Performance, 2012, 21(3):424-428.

[2]Leng Y X, Chen J Y, Yang P, et al. Mechanical properties and platelet adhesion behavior of diamond-like carbon films synthesized by pulsed vacuum arc plasma deposition[J]. Surface Science, 2003, 531(2):177-184.

[3]Song J, Wu X, Huang N, et al. The new stent materials-adsorbed fibrinogen and albumin, heparin on the blood compatibility of titanium oxide[J]. Journal of Biomedical Engineering, 2007, 24(5): 1097-1101.

[4]Chen C, Chen J Y, Li Q L, et al. The research of self-assembly behavior of bovine serum albumin to control the platelet adhesion on titanium surface[J]. Journal of Functional Materials, 2009, 40(4): 660-662.

[5]Qi P, Li X, Yang Y, et al. Constructing biomimic catalytic coating with controlled nitric oxide release properties by immobilizing 3,3-diselenodipropionic acid on plasma polymerized allylamine film[J]. Plasma Processes & Polymers, 2014, 11(10):952-960.

[6]Oh B K, Meyerhoff M E. Spontaneous catalytic generation of nitric oxide from S-nitrosothiols at the surface of polymer films doped with lipophilic copperII complex[J]. Journal of the American Chemical Society, 2003, 125(32):9552-9553.

[7]Oh B K, Meyerhoff M E. Catalytic generation of nitric oxide from nitrite at the interface of polymeric films doped with lipophilic Cu(Ⅱ)-complex: a potential route to the preparation of thromboresistant coatings[J]. Biomaterials, 2004, 25(2):283-293.

[8]Singh R J, Hogg N, Joseph J, et al.Mechanism of nitric oxide release from S-nitrosothiols[J]. Journal of Biological Chemistry, 1996, (31):18596-18603.

[9]Weng Y J, Song Q, Zhou J Y, et al. Immobilization of selenocystamine on TiO2surfaces for in situ catalytic generation of nitric oxide and potential application in intravascular stents[J]. Biomaterials, 2011, (32): 1253-1263.

[10]Zhang L P, WengY J, Zhou Y J,et al. Building a catalytic activity layer improve antiplatelet adhesion properties on TiO2surfaces[J]. Journal of Functional Materials,2010,41(7):1158-1161.

[11]Xi Z Y, Xu Y Y, Zhu L P, et al. A facile method of surface modification for hydrophobic polymer membranes based on the adhesive behavior of poly (DOPA) and poly (dopamine)[J]. Journal of Membrane Science, 2009, 327: 244-253.

[12]Du C P, Liang W P, Tang J. Chiral pharmaceutical chemistry and biology and research [J]. Progress in Chemistry, 2002, 14 (2): 156-158.

[13]Berardi F, Loiodice F, Fracchiolla G, et al. Synthesis of chiral 1-[omega-(4-chlorophenoxy)alkyl]-4-methylpiperidines and their biological evaluation at sigma 1, sigma 2, and sterol delta 8-delta 7 isomerase sites[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 46(11):2117-2124.

[14]Wang X, Gan H, Sun T. Chiral design for polymeric biointerface: the influence of surface chirality on protein adsorption[J]. Advanced Functional Materials, 2011, 21: 3276-3281.

[15]Zhou F, Yuan L, Li D, et al. Cell adhesion on chiral surface: The role of protein adsorption[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2012, 90: 97-101.

[16]Alegria A E, Dejesus-Andino F J, Sanchez-Cruz P. Quinone-enhanced sonochemical production of nitric oxidefrom s-nitrosoglutathione[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2009,16: 190-196.

Study of cystine sodium immobilization and anti-platelet activation on TiO2film

WANG Hong1,2, FAN Yonghong2, HAN Honghong2, PAN Xiaxin2,WENG Yajun2, HUANG Nan2

(1.School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China;2.Key Laboratory for Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education,School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China)

Abstract:It is acknowledged that NO releasing by degradation of endogenous NO donor catalyzed by biomaterials can significantly improve blood compatibility of the surfaces. And D-cystinesodium, a poly-dopamine coating was used to as a linker to immobilize cystine sodium with different chirality such as L-cystinesodium on TiO2 films to construct catalytic activity. The effect of immobilizing cystine sodium with different chirality on anti-platelet activation was analyzed. The X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and the water contact angle test results showed that, in the same preparation process, the surfaces with either L-cystinesodium or D-cystinesodium immobilization have similar physical and chemical properties, while there are different biological properties of the two kinds of thesurfaces.Surfaces with D-cysteine sodium immobilization show higher hydrophilicproperties with higher standard error after pre-adsorption of BSA, while surfaces with L-type immobilization show higher NO release by catalyzing endogenous NO and enhancement of anti-platelet activation ability in vitro.

Key words:TiO2 films; cystine sodium; chirality; nitric oxide; platelet adhesion

DOI:10.3969/j.issn.1001-9731.2016.02.002

文獻標識碼：A

中圖分類號：R318.08

作者簡介：王宏(1989-)，女，山東煙臺人，碩士，師承翁亞軍副教授和黃楠教授，從事生物材料表面功能化研究。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31270020)；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(2682014CX006)；四川省青年基金資助項目(2013JQ0043)

文章編號：1001-9731(2016)02-02006-04

收到初稿日期：2015-02-24 收到修改稿日期：2015-06-19 通訊作者：翁亞軍，E-mail：wengyj7032@swjtu.edu.cn