石金敏，徐夢(mèng)菲，周　燦，鄒青偉，張曉燕*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442000；2.武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖北武漢430000）

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不同組織器官中華蛇根草綠原酸含量的比較研究

石金敏1，徐夢(mèng)菲2，周燦1，鄒青偉1，張曉燕1*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北十堰442000；2.武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院，湖北武漢430000）

〔摘要〕目的比較中華蛇根草不同組織器官中綠原酸的含量。方法選用Inertsil C(18)色譜柱，以甲醇-0.02％磷酸溶液（20∶80）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為325 nm，柱溫40℃。結(jié)果綠原酸在0.027～1.700 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2月花期采收的中華蛇根草莖、葉、花中綠原酸的含量分別為3.39、0.77、22.79 mg/g。結(jié)論中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量差異較大，其中花含量最高。該方法能準(zhǔn)確、快速地進(jìn)行定性定量檢測(cè)，可用于中華蛇根草中綠原酸含量的測(cè)定。

〔關(guān)鍵詞〕中華蛇根草；綠原酸；高效液相色譜法

中華蛇根草Ophiorrhiza Chinensis LO為茜草科蛇根草屬的植物，是中國(guó)特有的物種，主產(chǎn)于四川、貴州、湖北、湖南、江西、安徽、福建、廣東、廣西等地?；ü诹哑趁嬗谐?，無(wú)角狀附屬體或附屬體很小；萌果較小，寬不超過(guò)10毫米,花冠裂片背面有闊翅,葉基部?jī)蓚?cè)對(duì)稱(chēng)或近對(duì)稱(chēng)，干后常變淡紅。蛇根草屬植物約200余種，廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶，我國(guó)已知68種，該屬植物主要含有甾醇、喜樹(shù)堿、蒽醌衍生物、胡蘿卜苷和木犀草素等活性成分[1]。湖北武當(dāng)山地區(qū)地處亞熱帶和溫帶的分水嶺，氣候溫和，中華蛇根草資源非常豐富。為了考察其藥效與活性成分的關(guān)聯(lián)性，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其富含綠原酸[2]。因此，本文建立了HPLC測(cè)定中華蛇根草中綠原酸含量，并對(duì)不同部位的綠原酸含量進(jìn)行了比較，對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為有效控制藥材質(zhì)量及合理利用植物資源提供參考。

1材料與儀器

1.1材料

中華蛇根草樣品2月采于湖北十堰市牛頭山森林公園，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部張曉燕主任藥師鑒定為茜草科蛇根草屬植物中華蛇根草Ophiorrhiza chinensis LO。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98％，批號(hào):110753-200413）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2儀器

日本島津LC-20AT高效液相色譜儀（島津有限公司）；KQ-500DV超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004萬(wàn)分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；KWY-101型電熱干燥箱（武漢市武昌實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

2方法與結(jié)果

2.1樣品的采集

2014年2月于牛頭山森林公園老虎寨，海拔582.10米處采集花期全草。采集當(dāng)天分別洗凈，置于50℃恒溫箱中干燥36 h，按全草、莖、葉、花不同部位分類(lèi)，分別粉碎，過(guò)四號(hào)篩，備用。

2.2色譜條件[3]

色譜柱：Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相（甲醇-0.02％磷酸水溶液，20∶80）；流速1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm；柱溫為40℃，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算均不低于3 000。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　中華蛇根草不同組織HPLC圖譜

2.3供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min（超聲功率500W），放冷至室溫，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含42.5 μg的溶液，即得綠原酸對(duì)照品溶液。

2.5線性關(guān)系考察

分別取適量的綠原酸對(duì)照品，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并添加至刻度，搖勻，以甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e得到質(zhì)量濃度為170.00、85.00、42.50、21.25、10.63、5.31、2.66 μg/mL綠原酸對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：

綠原酸的進(jìn)樣量在0.027～1.700 μg之間呈線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

取中華蛇根草全草，同“2.3”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，同法測(cè)定，計(jì)算RSD 0.35％，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取中華蛇根草全草，同“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同“2.2”項(xiàng)法測(cè)定，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD 0.47％，表明綠原酸在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取中華蛇根草全草6份，制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果顯示綠原酸峰面積的RSD 0.69％，方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱(chēng)取中華蛇根草全草6份，每份約0.1 g，精密加入0.90 mg綠原酸，同“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定綠原酸的含量，結(jié)果表明該方法回收率良好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　綠原酸的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果?。╪=6）

2.10樣品中綠原酸的含量測(cè)定

取不同組織器官中華蛇根草樣品，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行處理，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　2月中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量　（±s，n=6）

表2　2月中華蛇根草不同組織器官綠原酸含量?。ā纒，n=6）

部位莖葉花全草綠原酸含量（mg/g）3.39±0.01 0.77±0.01 22.79±0.06 8.82±0.03

3討論

綠原酸具有清除自由基、抗菌消炎[4]、抗病毒、降糖、降脂、保肝利膽、保腎[5]等多種功效。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)綠原酸類(lèi)物質(zhì)有抗癌[6]、抗艾滋病的作用，可作為先導(dǎo)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)抗癌、抗艾滋病藥物。綠原酸作為葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)移酶的抑制劑，可以啟動(dòng)中性粒細(xì)胞及前髓細(xì)胞HL-60的程序性細(xì)胞死亡，抑制人Hep3B肝癌細(xì)胞的金屬硫蛋（(MMP)分泌，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移。因此，綠原酸對(duì)腫瘤具有化學(xué)預(yù)防作用。有研究表明，綠原酸能通過(guò)增強(qiáng)S-腺苷-L-高氨酸的合成來(lái)抑制DNA甲基化，從而阻止癌細(xì)胞基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[7]。

由上述測(cè)定結(jié)果可知，中華蛇根草不同組織器官中綠原酸的含量依次為花＞莖＞葉。因此，利用中華蛇根草中綠原酸的藥理作用在臨床用于抗菌、消炎、解毒、清除氧自由基和抗癌的治療時(shí)，選擇花較合適。

此外，其花中綠原酸的含量為22.79 mg/g，含量較高，由此，可以推測(cè)中華蛇根草具有清除自由基、抗菌、抗病毒、降糖、降脂或抗腫瘤等功效，但是目前未見(jiàn)中華蛇根草臨床應(yīng)用和藥理藥效的研究報(bào)道，其富含綠原酸是否與其藥效有關(guān)聯(lián)，還需相應(yīng)的臨床觀察及藥效試驗(yàn)來(lái)佐證，本研究為野生中華蛇根草資源的充分利用，明確其藥用價(jià)值提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wang W, Lu Y, Li L, et al. Distribution of anticancer drug in Ophiorrhiza japonica [J]. Joumal of Shanghai Normal University (Natural Sciences), 2009, 38 (1):59-62.

[2]張婷,美爾哈巴·熱西提,林瀟,等.HPLC-MS/MS法測(cè)定銀黃顆粒中綠原酸和黃芩苷[J].中草藥,2012,43(4):711-713.

[3]王華，蔡萍，萬(wàn)丹，等.雙黃花片HPLC指紋圖譜的研究及其綠原酸和黃苓苷含量測(cè)定[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32 （7）：41-44.

[4] Wang LJ, Li JH, Gao JJ, et al. Inhibitory effect of chlorogenic acid on fruit russeting in‘Golden Delicious’apple[J]. Scientia Horticulturae, 2014,178:14-22.

[5] Robert D, Olga C, Vesna S, et al. Renoprotective mechanisms of chlorogenic acid in cisplatin-induced kidney injury [J]. Toxicology,2014,324:98-107.

[6] Luciana GN, Maria V, Meritxell RF, et al. Promising antioxidant and anticancer (human breast cancer) oxidovanadium(IV) complex of chlorogenic acid. Synthesis, characterization and spectroscopic examination on the transport mechanism with bovine serum albumin[J]. Journal of Inorganic Biochemistry,2014,135:86-99.

[7]陳紹華,王亞琴,羅立新.天然產(chǎn)物綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品科技, 2008(2):195-198.

（本文編輯蘇維）

Comparative Study on the Content of Chlorogenic Acid in Ophiorrhiza chinensis from Different Organs

SHI Jinmin1, XU Mengfei2, ZHOU Can1, ZOU Qingwei1, ZHANG Xiaoyan1*
(1. Department of Pharmacy, Renmin Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine, Shiyan, HuBei 442000, China; 2. Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, HuBei 430000, China)

Abstract〔〕Objective To determine the content of chlorogenic acid in different organs of Ophiorrhiza chinensis. Methods The contents of chlorogenic acid was determined with chromatographic column Inertsil C(18), And its mobile phase was methanol: 0.02％ phosphoric acid solution (20:80), the flow rate was 1.0 mL/min, detection wavelength was 325 nm and the column temperature was 40℃. Results There was a good linear relationship of chlorogenic acid between 0.027 and 1.700 μg (r=0.999 9). The content of chlorogenic acid of Japanese snakeroot which were harvested during February flowering period, in stems, leaves, flowers were 3.39, 0.77, 22.79 mg/g, respectively. Conclusion The contents of chlorogenic acid, which are also different in different organs of the Ophiorrhiza chinensis, the highest of which is the flower. The method is accurate and quick in qualitative identification and quantitative assay, which can be used for the quality control of Ophiorrhiza Chinensis.

Keywords〔〕HPLC; Ophiorrhiza chinensis; chlorogenic acid

〔通訊作者〕*張曉燕，女，主任藥師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：coarff66@126.com。

〔作者簡(jiǎn)介〕石金敏，女，碩士，藥師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

〔基金項(xiàng)目〕湖北省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃“武當(dāng)山區(qū)道地藥材產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)湖北協(xié)同創(chuàng)新中心”鄂教科函[2012]56號(hào)。

〔收稿日期〕2015-09-09

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R284.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕B

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.007