劉新彩，徐佩茹，李 敏，艾比白·艾爾肯，王紅清

830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(劉新彩，徐佩茹，李敏，艾比白·艾爾肯，王紅清)；新疆維吾爾自治區(qū)循證醫(yī)學(xué)研究所(徐佩茹，李敏)

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·論著·

新疆哈薩克族肥胖兒童菌群人源化動(dòng)物模型的建立

劉新彩，徐佩茹，李 敏，艾比白·艾爾肯，王紅清

830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(劉新彩，徐佩茹，李敏，艾比白·艾爾肯，王紅清)；新疆維吾爾自治區(qū)循證醫(yī)學(xué)研究所(徐佩茹，李敏)

【摘要】目的利用無(wú)菌小鼠建立新疆哈薩克族肥胖兒童菌群人源化(HFA)動(dòng)物模型，為深入研究哈薩克族兒童肥胖的病理生理機(jī)制提供新的研究方式。方法收集新疆哈薩克族7～13歲肥胖兒童新鮮糞便，男女各10例。20只3周齡無(wú)菌級(jí)C57BL/6J小鼠(雌雄各半)，按照性別進(jìn)行分組并編號(hào)。小鼠灌胃接種哈薩克族肥胖兒童糞便菌懸液0.1 ml/次，隔日一次，共接種3次，且接種時(shí)遵循性別一致原則。于接種后第7天收集小鼠新鮮糞便標(biāo)本，提取基因組DNA后，采用特異性引物對(duì)16S rRNA V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用DGGE方法分離并鑒定，以了解HFA動(dòng)物模型中腸道菌群的定植情況。結(jié)果接種哈薩克族肥胖兒童腸道菌群后的無(wú)菌小鼠盲腸均減小為正常小鼠大小；HFA動(dòng)物模型的PCR-DGGE指紋圖譜顯示各觀察標(biāo)本均形成復(fù)雜而多樣的菌屬條帶。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功利用無(wú)菌C57BL/6J小鼠建立哈薩克族肥胖兒童HFA動(dòng)物模型，該動(dòng)物模型是探索哈薩克族兒童特征性肥胖與腸道菌群關(guān)系的新的選擇方式。

【關(guān)鍵詞】肥胖癥；兒童；哈薩克族；模型，動(dòng)物 ；菌群人源化動(dòng)物；無(wú)菌小鼠

劉新彩，徐佩茹，李敏，等.新疆哈薩克族肥胖兒童菌群人源化動(dòng)物模型的建立[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(8)：936-940.[www.chinagp.net]

Liu XC，Xu PR，Li M，et al.Establishment of human flora-associated animal model for obese children of Xinjiang Kazakh nationality[J].Chinese General Practice，2016，19(8)：936-940.

近年來(lái)，肥胖現(xiàn)象在全世界快速蔓延，并呈低齡化趨勢(shì)[1]。肥胖是引起糖尿病、心腦血管疾病等的重要危險(xiǎn)因素[2]，肥胖兒童感染性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的患病率和病死率均遠(yuǎn)高于正常兒童。新疆地區(qū)學(xué)齡兒童流行病學(xué)調(diào)查顯示，哈薩克族兒童肥胖患病率遠(yuǎn)高于維、漢、回等民族，并高于同期國(guó)內(nèi)學(xué)齡兒童平均肥胖患病率[3-4]。因此，在哈薩克族兒童人群中實(shí)施早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)和早診斷肥胖癥的策略和措施至關(guān)重要。

研究顯示，腸道主要菌群比例失衡在哈薩克族兒童肥胖發(fā)生中發(fā)揮重要作用[5-6]，為探索其作用機(jī)制，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型成為重要手段之一。無(wú)菌動(dòng)物作為微生物背景最清晰的動(dòng)物，是研究腸道菌群最有效的動(dòng)物模型之一[7-8]。本研究旨在通過(guò)建立菌群人源化(HFA)動(dòng)物模型，模擬哈薩克族兒童肥胖的特征性腸道菌群環(huán)境，為研究哈薩克族兒童肥胖提供新的選擇方式。

1材料與方法

1.1糞便采集根據(jù)2004年由國(guó)際生命科學(xué)學(xué)會(huì)中國(guó)肥胖問(wèn)題工作組領(lǐng)導(dǎo)制定的《中國(guó)學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn)》[9]，以年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)指標(biāo)為基礎(chǔ)，于2014年9—12月選取新疆烏魯木齊市周邊地區(qū)7～13歲哈薩克族肥胖兒童20例，男、女各10例。納入兒童排除遺傳、藥物、內(nèi)分泌、代謝及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的肥胖及肥胖綜合征，入組前6個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，家屬均簽署知情同意書。身高、體質(zhì)量的測(cè)量由兒科臨床工作人員實(shí)施，儀器均經(jīng)過(guò)校正。脫鞋帽，穿單衣，測(cè)立式身高，精確至0.1 cm；體質(zhì)量精確至0.1 kg。采集肥胖兒童清晨第一次排出的新鮮糞便尾便，無(wú)菌、厭氧條件下稱量、標(biāo)記后置于無(wú)菌離心管中。迅速保存于-80 ℃冰箱，用前解凍，切忌反復(fù)凍融。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3周齡無(wú)菌C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半，購(gòu)自上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，小鼠按照性別分為兩組，隨機(jī)進(jìn)行編號(hào)，雄性小鼠編號(hào)為A1～A10，雌性小鼠為A11～A20。小鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB-T14926.41-2001)飼養(yǎng)于無(wú)菌隔離器(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)中，環(huán)境溫度為20～26 ℃，濕度為40%～70%，光照周期明暗比為12 h∶12 h。無(wú)菌小鼠的飼料均經(jīng)40 kGy60Co-γ射線輻照消毒，小鼠自由采食和飲水，飲水、墊料、鼠籠和飲水瓶等均采用高溫高壓滅菌(121 ℃，60 min)。HFA模型構(gòu)建前1周取其糞便、毛發(fā)、墊料進(jìn)行微生物檢測(cè)，確保小鼠體內(nèi)外均無(wú)菌，細(xì)菌16S DNA V3區(qū)引物PCR檢測(cè)陰性[10](見圖1)。本研究得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：IACUC-20140214067)。

圖1　無(wú)菌小鼠16S DNA V3區(qū)細(xì)菌檢測(cè)

1.3方法

1.3.1制備糞便菌懸液配置含10%(vol/vol)三酰甘油的PBS緩沖液(0.05 mol/L，pH=7.4)，121 ℃滅菌30 min，置于厭氧罐中預(yù)還原處理24 h。分次解凍已制備的兒童糞便標(biāo)本，每2 g懸浮于40 ml上述處理過(guò)的PBS緩沖液中，稍靜置，吸取上清液即為糞便菌懸液。

1.3.2制備HFA小鼠模型小鼠按照性別分裝于2個(gè)無(wú)菌隔離器中，灌胃接種相同性別固定兒童的糞便菌懸液0.1 ml/次，隔日一次，共接種3次。7 d后，收集小鼠新鮮糞便標(biāo)本，-20 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜贒NA提取。

1.3.3引物設(shè)計(jì)與合成針對(duì)哈薩克族肥胖兒童糞便中的大多數(shù)細(xì)菌設(shè)計(jì)和合成特異性引物序列：16S上游引物：5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGG-CACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′，16S下游引物：5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′，GC夾序列為5′-GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCC G-3′﹝由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成﹞。擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度約200 bp。

1.3.4基因組16S rRNA的PCR擴(kuò)增按硅膠膜-離心柱法從小鼠糞便標(biāo)本中提取基因組DNA作為PCR的模板，采用上述特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因的可變V3區(qū)。PCR反應(yīng)體系為60 μl，成分包括10×PCR buffer 6 μl、1.5 mmo/L MgCl2溶液4.8 μl、dNTP 4.8 μl、上下游引物各1.2 μl、模板DNA 2.4 μl、Taq DNA聚合酶4.8 μl，最后加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至60 μl。采用Perkin Elmer TM 9700型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。前20個(gè)循環(huán)：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s；之后每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.5 ℃，72 ℃延伸1 min。后10個(gè)循環(huán)：94 ℃變性30 s，65 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；最后一循環(huán)72 ℃延伸10 min。

1.3.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析采用DcodeTM Universal Mutation Detection System(Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，其變性梯度范圍為30%～60%，上樣量為20 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在1×TAE電泳緩沖液中，恒溫60 ℃、電壓85 V的條件下運(yùn)行16 h[11]。電泳結(jié)束后，用硝酸銀染色20 min，去離子水漂洗2次，各10 min，用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)觀察每個(gè)樣品的電泳條帶并拍照。

1.4建模成功的標(biāo)準(zhǔn)PCR產(chǎn)物運(yùn)用DGGE方法分離并鑒定，根據(jù)電泳條帶的多寡和位置初步辨別菌屬的種類多少，粗略分析菌群的多樣性，從而確定是否建模成功。

2結(jié)果

2.1生存狀態(tài)在接種兒童糞便菌懸液初期，雌性小鼠由于腸道反應(yīng)，編號(hào)為A15、A18、A19的小鼠死亡，余小鼠生存狀態(tài)良好，無(wú)菌隔離器內(nèi)小鼠總體生存環(huán)境良好。

2.2生理解剖無(wú)菌C57BL/6J小鼠由于腸道內(nèi)沒(méi)有菌群生長(zhǎng)，不能正常代謝食物，造成食物殘?jiān)鼫粲诿つc，故小腹膨脹，解剖見盲腸膨大。HFA小鼠解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)盲腸減小為正常小鼠盲腸大小，由此可知HFA小鼠體內(nèi)已有菌群定植(見圖2、3)。

圖2　無(wú)菌小鼠的盲腸

2.3PCR-DGGE圖譜分析HFA小鼠腸道菌群種類繁多且數(shù)量龐大，各標(biāo)本(死亡小鼠除外)均可觀察到清晰的電泳條帶，且具有很多共同的條帶，說(shuō)明HFA小鼠存在共有的細(xì)菌種屬；其共有條帶的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)弱不等，說(shuō)明小鼠共同細(xì)菌種屬的數(shù)量存在差異。DGGE指紋圖譜半定量分析條帶強(qiáng)度示意圖見圖4、5。

圖4　雄性HFA小鼠的PCR-DGGE圖譜

圖5　雌性HFA小鼠的PCR-DGGE圖譜

3討論

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于肥胖環(huán)境因素的研究顯示，腸道菌群與體脂的沉積及肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[12-17]。Backhed等[18]研究提示，腸道微生物能促進(jìn)單糖的吸收，影響機(jī)體能量的吸收、儲(chǔ)存。Ley等[19]發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠擬桿菌門細(xì)菌數(shù)量顯著減少，同時(shí)硬壁菌門細(xì)菌數(shù)量明顯增加；肥胖小鼠與非肥胖小鼠的腸道微生物群落的差異可以轉(zhuǎn)移和復(fù)制。上述研究均提示個(gè)體腸道微生物具有特異性的代謝效能，而微生物所構(gòu)成的特定特征可能誘發(fā)肥胖，腸道菌群比例失衡在動(dòng)物發(fā)生肥胖中發(fā)揮一定作用。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)腸道主要菌群比例失衡在哈薩克族兒童的肥胖發(fā)生中發(fā)揮作用[5-6]。

雖然通過(guò)動(dòng)物研究，腸道菌群對(duì)動(dòng)物發(fā)生肥胖的影響已經(jīng)得到確認(rèn)，但要清楚闡述人腸道菌群對(duì)人類肥胖及肥胖引起的代謝性疾病的影響卻很困難。因?yàn)樵谌梭w內(nèi)研究腸道菌群時(shí)，遺傳、環(huán)境及飲食等因素對(duì)腸道菌群的影響難以控制，人志愿者體內(nèi)的研究結(jié)果往往具有較大的局限性。無(wú)菌動(dòng)物是通過(guò)無(wú)菌剖宮產(chǎn)手術(shù)或無(wú)菌胚胎移植進(jìn)行無(wú)菌化獲得的動(dòng)物，利用無(wú)菌飼養(yǎng)方法維持于無(wú)菌隔離器，且現(xiàn)有方法檢測(cè)不到活的微生物和寄生蟲[20-21]。無(wú)菌動(dòng)物作為微生物背景最清晰的動(dòng)物，可有效進(jìn)行菌群、基因及飲食等環(huán)境因素控制，是研究腸道菌群對(duì)人類疾病及健康影響的最有效動(dòng)物模型之一。因此，用無(wú)菌動(dòng)物制作的HFA模型可為研究人腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)及代謝特征提供良好模型[7]。

本研究選用無(wú)菌C57BL/6J小鼠灌胃接種單純性肥胖的哈薩克族學(xué)齡兒童的糞便菌懸液，建立哈薩克族肥胖兒童HFA動(dòng)物模型，且在構(gòu)建過(guò)程中遵循性別一致原則[22-23]，不僅控制了遺傳、環(huán)境及飲食等影響，而且避免了人體試驗(yàn)的倫理學(xué)問(wèn)題[24]。在研究過(guò)程中，從HFA小鼠模型的糞便標(biāo)本中提取基因組DNA，作為PCR的模板，采用針對(duì)哈薩克族肥胖兒童腸道菌群設(shè)計(jì)和合成的特異性引物[25]，擴(kuò)增HFA小鼠模型腸道菌群的16S rRNA基因的可變V3區(qū)，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用DGGE方法分離并鑒定，根據(jù)電泳條帶的多寡和位置辨別菌屬的種類多少，粗略分析HFA小鼠模型中腸道菌群的多樣性，同時(shí)反映哈薩克族肥胖兒童的腸道菌群在小鼠腸道內(nèi)的定植情況，從而判定該無(wú)菌小鼠是否成功建立哈薩克族肥胖兒童HFA模型。

本研究結(jié)果顯示，灌胃接種哈薩克族肥胖兒童腸道菌群后的無(wú)菌小鼠盲腸減小為正常小鼠盲腸大小，盲腸內(nèi)幾乎無(wú)食物殘?jiān)?，推測(cè)哈薩克族肥胖兒童的腸道菌群已定植于無(wú)菌小鼠腸道內(nèi)，參與HFA小鼠的食物代謝。進(jìn)一步通過(guò)HFA小鼠模型的PCR-DGGE指紋圖譜顯示，除在接種初期由于腸道反應(yīng)死亡的小鼠外，各HFA小鼠糞便中均可觀察到清晰的多條電泳條帶，反映了菌屬的多樣性；各觀察標(biāo)本間具有很多共同的電泳條帶，代表其存在共同細(xì)菌種屬；不同小鼠的共同電泳條帶的信號(hào)強(qiáng)度并不相同，表示其雖然具有相同的細(xì)菌菌屬，但菌屬數(shù)量存在差別。因此，本實(shí)驗(yàn)成功在無(wú)菌小鼠腸道內(nèi)模擬哈薩克族肥胖兒童特征性的腸道菌群環(huán)境。

PCR-DGGE圖譜較好地呈現(xiàn)了哈薩克族肥胖兒童復(fù)雜而多樣的腸道菌群環(huán)境，同時(shí)也證明了哈薩克族肥胖兒童的糞便可在無(wú)菌C57BL/6J小鼠實(shí)現(xiàn)接種，成功構(gòu)建了哈薩克族肥胖兒童HFA動(dòng)物模型，為進(jìn)一步探索哈薩克族兒童肥胖與腸道菌群的關(guān)系提供了新的選擇，為深入研究哈薩克族兒童肥胖的病理生理機(jī)制提供了新的研究方式。

本研究局限性：(1)由于不同細(xì)菌細(xì)胞壁的構(gòu)成、rRNA的序列不同，細(xì)菌擴(kuò)增結(jié)果也存在差異。因此，PCR-DGGE方法不能保證所有的細(xì)菌以相同的效率擴(kuò)增出來(lái)[26]；(2)有菌屬不易在無(wú)菌小鼠腸道內(nèi)定植，故個(gè)別菌屬可能在HFA小鼠模型的糞便中檢測(cè)不出，電泳條帶不能完整顯示菌群情況。本課題組將繼續(xù)致力于新疆哈薩克族兒童肥胖與腸道菌群關(guān)系的研究，為進(jìn)一步探索哈薩克族兒童肥胖的作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：劉新彩進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；李敏、艾比白·艾爾肯、王紅清進(jìn)行課題實(shí)施、評(píng)估、資料收集；徐佩茹進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：吳立波)

Establishment of Human Flora-associated Animal Model for Obese Children of Xinjiang Kazakh Nationality

LIUXin-cai，XUPei-ru，LIMin，etal.

DepartmentofPediatrics，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China

【Abstract】ObjectiveTo establish human flora associated (HFA) animal models related with Kazakh obese children in Xinjiang based on germ-free (GF) mice and to provide a new way for the further study of the physiopathologic mechanism of obese children of Kazakh nationality.MethodsWe collected fresh feces from 20 Xinjiang Kazakh obese children who were 7-13 years old;and each gender 10 cases.We selected 20 three-week-old GF C57BL/6J mice (half male and half female) and assigned them into two groups and numbered them.The mice received gavage inoculation of bacterium suspension once every two days，given three times totally and each time 0.1 ml;the principle of gender consistency was followed.On the 7th day after inoculation，fresh feces samples were collected，and genome and DNA were extracted;specific primers were employed to conduct PCR amplification on V3 region of 16S rRNA;DGGE method was adopted to separate and identify amplification products，in order to understand the engraftment of intestinal flora in HFA animal models.ResultsThe cecums of HFA mice were reduced to the normal size after inoculation;PCR-DGGE fingerprint of HFA mice showed that complex and diverse bacterial genus stripes formed in each sample.ConclusionThe establishment of HFA animals related with Kazakh obese children based on GF C57BL/6J mice was successful.HFA animal model is a new method for the study of the relationship between Kazakh obese children and gut microbiota.

【Key words】Obesity；Child；Kazakh；Models，animal；Human flora-associated animal;Germ free mice

(收稿日期：2015-10-14；修回日期：2015-12-31)

【中圖分類號(hào)】R 723.14

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.08.015

通信作者：徐佩茹，830054新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，新疆維吾爾自治區(qū)循證醫(yī)學(xué)研究所；

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460165)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C056)

E-mail：xupeiru126@126.com