李強(qiáng) 包訓(xùn)迪 劉元 趙冰 歐喜超 趙雁林

?

MTBDRplus V2用于診斷涂陰疑似肺結(jié)核患者的效果評(píng)價(jià)

李強(qiáng) 包訓(xùn)迪 劉元 趙冰 歐喜超 趙雁林

目的 評(píng)價(jià)MTBDRplus V2線性探針技術(shù)(簡(jiǎn)稱“MTBDRplus V2”)用于診斷涂陰疑似肺結(jié)核患者的檢測(cè)效能。 方法 連續(xù)納入2014年1—12月在安徽省胸科醫(yī)院和西安市胸科醫(yī)院就診的涂陰疑似肺結(jié)核患者1973例，對(duì)其1973份痰標(biāo)本同時(shí)開(kāi)展MTBDRplus V2和MGIT 960快速液體培養(yǎng)(mycobacterial detection system，BACTECTMMGITTM960，簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)法”)，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)的菌株，開(kāi)展利福平和異煙肼藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，對(duì)兩種方法耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致樣本進(jìn)行耐藥相關(guān)基因測(cè)序驗(yàn)證。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法對(duì)MTBC檢出率的比較使用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)利福平和異煙肼耐藥基因檢測(cè)的效能比較分析用敏感度、特異度進(jìn)行效果評(píng)估。 結(jié)果 1973例涂陰疑似肺結(jié)核患者中，MTBDRplus V2和MGIT 960培養(yǎng)法對(duì)MTBC的檢出率分別為27.67%(546/1973)和26.76%(528/1973)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.974)。以MGIT 960培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)痰標(biāo)本中MTBC的敏感度和特異度分別為86.74%(458/528)和93.84%(1356/1445)。以MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥性的敏感度分別為94.34%(50/53)和77.38%(65/84)，特異度為96.62%(372/385)和98.02%(347/354)。結(jié)論 MTBDRplus V2可快速準(zhǔn)確檢測(cè)出涂陰疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本中的MTBC，并可同時(shí)檢測(cè)利福平和異煙肼對(duì)MTBC的藥物敏感性，其檢測(cè)結(jié)果敏感度和特異度高，對(duì)于結(jié)核病防控有很好的應(yīng)用價(jià)值。

結(jié)核, 肺； 分子探針技術(shù)； 分枝桿菌, 結(jié)核； 痰； 藥物敏感性試驗(yàn)； 評(píng)價(jià)研究

結(jié)核病是嚴(yán)重危害公眾健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，每年數(shù)百萬(wàn)例感染患者，死亡患者在感染性疾病中居第二位[1]。中國(guó)是全球第三大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，結(jié)核病發(fā)病患者始終居傳染病前列[1]。2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，人群中活動(dòng)性肺結(jié)核患病率沒(méi)有明顯下降，但涂陽(yáng)患者比例大幅度下降[2]。由于缺乏有效的診斷涂陰結(jié)核病的病原學(xué)檢測(cè)方法，使涂陰結(jié)核病特別是耐藥結(jié)核病患者不能得到及時(shí)有效的診斷和治療。

MTBDRplus V1(Hain Lifescience,德國(guó))是一種可以通過(guò)反向探針雜交技術(shù)快速檢測(cè)樣本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)，以及利福平和異煙肼耐藥性的分子技術(shù)，報(bào)告時(shí)間短(6～8 h)，近幾年在全球范圍已廣泛應(yīng)用[3-6]，2008年被WHO推薦用于涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的耐藥診斷[7]。與MTBDRplus V1相比，MTBDRplus V2(Hain Lifescience,德國(guó))極大提高了檢測(cè)樣本中MTBC的敏感度，可直接對(duì)涂陰肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)[8]。然而，目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有關(guān)于MTBDRplus V2用于臨床診斷的研究報(bào)道。本研究以涂陰疑似肺結(jié)核患者為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)該技術(shù)用于診斷涂陰疑似肺結(jié)核患者的應(yīng)用價(jià)值，為涂陰疑似肺結(jié)核患者的診斷提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

一、患者來(lái)源

連續(xù)納入2014年1—12月在安徽省胸科醫(yī)院和西安市胸科醫(yī)院就診的胸部X線表現(xiàn)不典型、咳嗽咯痰>2周、有或無(wú)肺結(jié)核臨床癥狀的連續(xù)3次痰涂片鏡檢抗酸桿菌陰性(簡(jiǎn)稱“涂陰”)的疑似肺結(jié)核患者1973例(研究中使用臨床剩余痰)，其中安徽省胸科醫(yī)院966例(份)，西安市胸科醫(yī)院1007例(份)。

二、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.痰標(biāo)本處理：痰標(biāo)本采用中和離心法去污染處理，按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化流程[9]，采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH (NALC-NaOH)消化液處理，消化后的菌液沉淀重懸于2 ml的磷酸鹽緩沖液中，分裝兩份分別進(jìn)行BACTEC MGIT 960快速液體培養(yǎng)(mycobacterial detection system，BACTECTMMGITTM960，簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)法”)和MTBDRplus V2線性探針技術(shù)(簡(jiǎn)稱“MTBDRplus V2”)檢測(cè)。

2. MGIT 960培養(yǎng)法和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)：加入0.5 ml處理后的痰標(biāo)本至MGIT 960培養(yǎng)管(含0.8 ml OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑)中，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性鑒定為MTBC的菌株，嚴(yán)格按照操作手冊(cè)將其加入含有利福平(1 μg/ml)和異煙肼(0.1 μg/ml)藥物的培養(yǎng)管中，開(kāi)展利福平和異煙肼的耐藥檢測(cè)。

3.MTBDRplus V2 檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)在4個(gè)獨(dú)立房間進(jìn)行，包括試劑準(zhǔn)備間、模版制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和雜交區(qū)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照MTBDRplus V2操作說(shuō)明，取0.5 ml處理后的痰標(biāo)本13 000×g離心5 min，棄上清，沉淀用100 μl分子級(jí)雙蒸水懸浮，95 ℃水浴20 min提取核酸DNA備用；每個(gè)樣本取5 μl核酸DNA加入含有35 μl AM-B和10 μl AM-A試劑的擴(kuò)增體系中(Hain, MTBDRplus V2試劑盒)，PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；取20 μl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、耦聯(lián)和顯色后，根據(jù)試紙條上的探針顯色結(jié)果判定樣本中是否含有MTBC及其對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。

4.測(cè)序：對(duì)兩種方法耐藥檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行耐藥相關(guān)基因測(cè)序驗(yàn)證。采用16SrRNA基因測(cè)序進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定，rpoB基因測(cè)序用于利福平耐藥基因檢測(cè)，katG和inhA用于異煙肼耐藥基因檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物由天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測(cè)序，序列提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)做同源性比較或多序列比對(duì)，引物序列見(jiàn)表1。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)MTBC檢出率的比較使用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MGIT 960培養(yǎng)法和MTBDRplus V2對(duì)MTBC、利福平和異煙肼耐藥基因檢測(cè)效能的比較分析用敏感度、特異度進(jìn)行效果評(píng)估。

結(jié) 果

一、兩種方法對(duì)MTBC檢出率的比較

MTBDRplus V2和MGIT 960培養(yǎng)法對(duì)MTBC檢出率分別為27.67%(546/1973)和26.76%(528/1973)，兩種方法檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.974)(表2)。

二、 兩種方法對(duì)MTBC 檢測(cè)效能的比較分析

以MGIT 960培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)MTBC的敏感度和特異度分別為86.74%(458/528)和93.84%(1356/1445)(表3)。

三、兩種方法對(duì)利福平耐藥基因檢測(cè)效能比較分析

以MGIT 960藥敏試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)利福平耐藥性的敏感度為94.34%(50/53)，特異度為96.62%(372/385)，不同研究現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)差異不大(表4)。對(duì)利福平基因型和表型耐藥結(jié)果不一致的16例樣本進(jìn)行rpoB基因測(cè)序，結(jié)果顯示12例樣本的測(cè)序結(jié)果與MTBDRplus V2檢測(cè)結(jié)果一致，一致率為75.00%。

表1 耐藥基因測(cè)序引物序列

表2 兩家醫(yī)院MTBDRplus V2和MGIT 960培養(yǎng)法對(duì)涂陰疑似肺結(jié)核患者M(jìn)TBC檢出率的比較

注a：培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序鑒定

表3 兩家醫(yī)院MTBDRplus V2對(duì)MTBC檢測(cè)的敏感度和特異度

表4 兩家醫(yī)院MTBDRplus V2進(jìn)行利福平藥物敏感性檢測(cè)的敏感度和特異度

表5 兩家醫(yī)院采用MTBDRplus V2進(jìn)行異煙肼藥物敏感性檢測(cè)的敏感度和特異度

四、兩種方法對(duì)異煙肼耐藥基因檢測(cè)效能比較分析

以MGIT 960培養(yǎng)法檢測(cè)異煙肼耐藥結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)異煙肼的敏感度為77.38%(65/84)，特異度為98.02%(347/354)(表5)。對(duì)異煙肼基因型和表型耐藥結(jié)果不一致的26例樣本進(jìn)行katG和inhA基因測(cè)序，結(jié)果顯示，23例樣本的測(cè)序結(jié)果與MTBDRplus V2檢測(cè)結(jié)果一致，一致率88.46%。

討 論

本研究率先通過(guò)臨床對(duì)照研究將有前景的MTBDRplus V2檢測(cè)方法用于涂陰疑似肺結(jié)核疾病的診斷中，結(jié)果表明 1973例患者中，MTBDRplus V2對(duì)MTBC檢出率為27.67%(546/1973)，與MGIT 960培養(yǎng)法的檢出率26.76%(548/1973)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.974)，但MTBDRplus V2檢測(cè)方法將報(bào)告時(shí)間從15 d縮短到了1 d[10]，與本研究一致。此外，以MGIT 960培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，MTBDRplus V2檢測(cè)MTBC的敏感度、特異度分別為86.74%(458/528)和 93.84%(1356/1445)，說(shuō)明其檢測(cè)效能高。MTBDRplus V2在檢測(cè)MTBC的同時(shí)還可以檢測(cè)MTBC對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。與MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，MTBDRplus V2檢測(cè)利福平耐藥性的敏感度達(dá)到94.34%(50/53)以上，而國(guó)內(nèi)研究報(bào)道，MTBDRplus V1檢測(cè)利福平耐藥性的敏感度僅88%[10]。對(duì)利福平基因型和表型耐藥結(jié)果不一致患者樣本進(jìn)行利福平耐藥相關(guān)基因(rpoB基因)耐藥決定區(qū)的測(cè)序驗(yàn)證，MTBDRplus V2和測(cè)序結(jié)果一致率為75.00%(12/16)，結(jié)果與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道相符[11]，但低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[12]，可能與不同國(guó)家流行菌株不同有關(guān)。

與MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果相比，MTBDRplus V2檢測(cè)異煙肼耐藥性的敏感度為77.38%(65/84)，造成敏感度較低的原因，可能是由于其檢測(cè)的耐藥相關(guān)基因?yàn)閗atG和inhA基因，這2個(gè)基因與異煙肼耐藥相關(guān)性一般為70%[13]。對(duì)異煙肼基因型和表型耐藥結(jié)果不一致的患者樣本進(jìn)行異煙肼耐藥相關(guān)基因(katG和inhA基因)耐藥決定區(qū)的測(cè)序驗(yàn)證，88.46%(23/26)的患者樣本的測(cè)序結(jié)果和MTBDRplus V2的檢測(cè)結(jié)果一致。有研究報(bào)道oxyR-ahpC等基因與異煙肼耐藥有一定相關(guān)性[14]。本研究中，MTBDRplus V2檢測(cè)異煙肼耐藥性的結(jié)果為“敏感”而MGIT 960培養(yǎng)法檢測(cè)異煙肼耐藥性的結(jié)果為“耐藥”的19例樣本中，測(cè)序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)katG和inhA存在突變。這一結(jié)果提示，MTBDRplus V2檢測(cè)異煙肼耐藥性的靶基因需要進(jìn)一步完善。

綜上所述，MTBDRplus V2檢測(cè)MTBC的敏感度和特異度高、時(shí)間短，診斷涂陰疑似肺結(jié)核的可靠性強(qiáng)，同時(shí)可以準(zhǔn)確檢測(cè)利福平和異煙肼的耐藥性，對(duì)指導(dǎo)涂陰疑似肺結(jié)核的防控具有重要意義。與其他分子檢測(cè)技術(shù)如GeneXpert MTB/RIF和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)等技術(shù)相比，MTBDRplus V2對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高，需要具備有4個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)區(qū)域，適合在地市級(jí)以上結(jié)核病診療機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。

志謝 安徽省胸科醫(yī)院和西安市胸科醫(yī)院的結(jié)核科醫(yī)生對(duì)本研究做出了杰出貢獻(xiàn)

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015. Geneva: World Health Organization, 2015.

[2] Wang L, Zhang H, Ruan Y, et al. Tuberculosis prevalence in China, 1990—2010; a longitudinal analysis of national survey data. Lancet, 2014,383(9934): 2057-2064.

[3] Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, et al. GenoType MTBDRplus assay for molecular detection of rifampicin and isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisstrains and clinical samples. J Clin Microbiol, 2008, 46(11): 3660-3667.

[4] Bang D, Bengard Andersen A, Thomsen VO. Rapid genotypic detection of rifampicin- and isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisdirectly in clinical specimens. J Clin Microbiol, 2006,44(7): 2605-2618.

[5] 李強(qiáng)，歐喜超，夏輝,等. Genotype MTBDRplus快速耐藥診斷方法在地市級(jí)結(jié)核病醫(yī)院應(yīng)用的評(píng)估研究.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013,14(1):35-38.

[6] 陳琛,馬遠(yuǎn)征.分子線性探針測(cè)定法在結(jié)核病診斷中的研究進(jìn)展.中國(guó)防癆雜志, 2016,38(3): 218-221.

[7] World Health Organization. Policy statement： Molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB). Geneva: World Health Organization, 2008.

[8] Crudu V, Stratan E, Romancenco E, et al. First evaluation of an improved assay for molecular genetic detection of tuberculosis as well as rifampin and isoniazid resistances. J Clin Microbiol, 2012, 50(4):1264-1269.

[9] Kent PT, Kubica GP. Public health mycobacteriology: a guide for the level Ⅲ laboratory. Atlanta GA:Centers for Disease Control and Prevention,1985.

[10] Li Q, Dong HY, Pang Y, et al. Multicenter evaluation of the molecular line probe assay for multidrug resistantMycobacteriumtuberculosisdetection in china. Biomed Environ Sci, 2015, 28(6): 464-467.

[11] Pang Y, Lu J, Wang Y, et al. Study of the rifampicin monoresistance mechanism inMycobacteriumtuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(2): 893-900.

[12] Kumar P, Balooni V, Sharma BK, et al. High degree of multi-drug resistance and hetero-resistance in pulmonary TB patients from Punjab state of India. Tuberculosis(Edinb), 2014, 94(1): 73-80.

[13] Rufai SB, Kumar P, Singh A, et al. Comparison of Xpert MTB/RIF with line probe assay for detection of rifampin-monoresistantMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2014, 52 (6): 1846-1852.

[14] Zhang Z, Lu J, liu M, et al. Genotyping and molecular chara-cteristics of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from China. J Infect, 2015, 70(4): 335-345.

(本文編輯：孟莉 范永德)

A performance evaluation of MTBDRplus V2 for tuberculosis diagnosis in smear negative pulmonary tuberculosis suspects

LIQiang,BAOXun-di,LIUYuan,ZHAOBing,OUXi-chao,ZHAOYan-lin.

NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the performance of MTBDRplus version 2 (MTBDRplus V2) line probe assay for diagnosis of TB in the suspects with smear negative pulmonary tuberculosis. Methods The people who were clinically suspected to have smear negative pulmonary tuberculosis (PTB) and detected in Anhui Chest Hospital and Xi’an Chest Hospital from January 2014 to December 2014 were consecutively enrolled into this study. A total of 1973 smear negative PTB suspects were enrolled and one sputum specimen was collected from each of them to conduct MTBDRplus V2 and BACTECTMMGITTM960 (MGIT 960) liquid culture, respectively. MGIT drug susceptibility testing (DST) for rifampin and isonozid was also performed once the liquid culture was positive andMycobacteriumtuberculosiscomplex (MTBC) was identified. Finally, the drug resistance related genes sequencing was performed for the samples with inconsistent results of drug resistance between MTBDRplus V2 and MGIT DST to confirm the drug resistance status. SPSS 22.0 was used for statistic analysis andχ2test was used to compare the detection rate of MTBC by using the two diagnostic methods. Statistical significance was defined asP<0.05. The sensitivity and specificity were applied to evaluate the performance of MTBDRplus V2 in the identification of MTBC and the detection of rifampincin and isonizid resistance. Results Among 1973 enrolled cases who were suspected to have smear negative PTB, the identification rate of MTBC by using MTBDRplus V2 and MGIT 960 were 27.67% (546/1973) and 26.76% (528/1973), respectively. The difference has no statistical significance (χ2=0.05，P=0.974). Compared with MGIT 960, the sensitivity and specificity of MTBDRplus V2 in the identification of MTBC was 86.74% (458/528) and 93.84% (1356/1445), respectively. Compared with MGIT DST，the sensitivity of MTBDRplus V2 in the detection of rifampicin and isonizid resistance was 94.34% (50/53) and 77.38% (65/84) respectively, and the specificity in the detection of rifampicin and isonizid resistance was 96.62% (372/385) and 98.02% (347/354), respectively. Conclusion MTBDRplus V2 is a rapid and reliable method in the diagnosis of MTBC among smear negative PTB suspects. At the same time, it also can tell us whether the patients diagnosed as having MTBC are susceptible to rifampin and isonizid or not, and both its sensitivity and specificity of drug resistance detection are high. Thus, this method has a good application value in the TB control and prevention.

Tuberculosis,pulmonary； Molecular line probe assay；Mycobacteriumtuberculosis； Sputum； Drug susceptibility testing； Evaluation studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.07.006

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2014ZX10003002)

102206 北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心 國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(李強(qiáng)、趙冰、歐喜超、趙雁林)；安徽省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科(包訓(xùn)迪)；西安市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科(劉元)

趙雁林，Email: zhaoyanlin@chinatb.org

2016-02-04)