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        維藥洋甘菊體外抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用研究

        2016-05-14 10:03:26蘭衛(wèi)郭玉婷陳陽段沐含耿直倪健
        云南中醫(yī)中藥雜志 2016年5期
        關(guān)鍵詞:洋甘菊抑制細(xì)胞增殖

        蘭衛(wèi) 郭玉婷 陳陽 段沐含 耿直 倪健

        摘要:目的研究洋甘菊提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞體外增值抑制的作用。方法洋甘菊提取物95%乙醇提取并純化,得到澄清的藥物溶液后,進(jìn)行細(xì)胞體外給藥實驗。采用CCK-8法測定不同濃度不同時間下洋甘菊提取物作用后Hela細(xì)胞存活率。結(jié)果藥物濃度為670μg/mL時,Hela細(xì)胞抑制率為29.35%。當(dāng)最高藥物濃度達(dá)到1500μg/mL時,Hela細(xì)胞抑制率為82.18%。隨著藥物濃度的增加,Hela細(xì)胞抑制率呈明顯上升趨勢。結(jié)論維藥洋甘菊提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。

        關(guān)鍵詞:洋甘菊;宮頸癌;Hela細(xì)胞;細(xì)胞增殖;抑制

        中圖分類號:R285.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:1007-2349(2016)05-0054-02

        德國洋甘菊(Matricaria chamomilia)又稱母菊,維吾爾語稱“巴木乃”,是新疆特色地產(chǎn)藥材[1]。根據(jù)近年來的藥理學(xué)研究表明,發(fā)現(xiàn)它有鎮(zhèn)靜、止痛及改善癌癥病人癥狀等作用[2]。

        宮頸癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康和生命的惡性腫瘤[3]。本實驗組采用人宮頸癌Hela細(xì)胞作為實驗?zāi)P?,研究洋甘菊提取物體外抗宮頸癌的抑制活性,擴(kuò)展洋甘菊的臨床用途。

        1材料

        1.1藥材洋甘菊于2015年采集自新疆和田地區(qū)策勒縣策勒鄉(xiāng),經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥系中藥資源教研室盛萍教授鑒定為德國洋甘菊(Matricaria chamomilia)的頭狀花序。

        1.2儀器酶標(biāo)儀;顯微鏡,離心機(jī),移液槍,超凈工作臺(BCM-1300A);CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i)。

        1.3試劑0.25%胰酶(批號:140609,北京協(xié)和細(xì)胞資源中心);胎牛血清(批號:20130511,蘭州百靈生物技術(shù)有限公司);DMEM培養(yǎng)液(批號:201305,Thermo Fisher公司);CCK-8(批號:JA611,DOJINDO laboratories)。

        1.4細(xì)胞人宮頸癌Hela細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所贈予。

        2方法

        2.1洋甘菊提取物的提取洋甘菊干燥花序2.0kg,加10倍量95 %乙醇浸泡30 min,加熱回流2次,每次60 min,過濾,合并兩次濾液,干燥,得到洋甘菊提取物。

        2.2洋甘菊提取物藥物溶液的配制洋甘菊提取物為粗提物,以DMSO助溶,用完全培養(yǎng)液稀釋(DMSO含量≤0.5%),配制成每mL含2 mg洋甘菊提取物的溶液,完全溶解后于離心機(jī)中離心,轉(zhuǎn)速12000 rpm,離心時間5 min,上清液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾,即得用于細(xì)胞給藥的澄清藥物溶液。

        2.3細(xì)胞抑制率測定采用參考文獻(xiàn)的方法[4],選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種3000 個/100 μL細(xì)胞懸液,24 h后給藥,根據(jù)前期預(yù)試結(jié)果,分別設(shè)9個濃度受試組(能反映濃度與療效的量-效關(guān)系)、陽性對照組、細(xì)胞對照組和正常組,陽性對照組加入順鉑(濃度為20 μg/mL)。同時,考察細(xì)胞毒性試驗,加入上述不含藥物的DMSO溶液,作為細(xì)胞對照組;加入正常培養(yǎng)基,作為正常組。再培養(yǎng)72 h,然后在細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL CCK-8,在37℃環(huán)境中孵育4 h,然后測定其450 nm吸光度,獲取受試藥物對腫瘤細(xì)胞抑制率和IC50[5]。

        2.4Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察根據(jù)上述細(xì)胞增殖抑制實驗,取12孔板,加入濃度為890、670 μg/mL的藥物,觀察藥物對細(xì)胞形態(tài)的影響。參照相關(guān)文獻(xiàn)[6],取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),每孔接種50000個/2 mL,培養(yǎng)24 h,實驗組分別加入加入濃度為890、670 μg/mL的洋甘菊提取物,對照組加入空白培養(yǎng)液,培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

        3結(jié)果

        3.1洋甘菊提取物對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用采用CCK-8法測定分別加入1500、1200、1000、890、670、460、330、180、95 μg/mL不同濃度藥物溶液作用72 h后Hela細(xì)胞的存活率,見圖1。與對照組未經(jīng)處理的Hela細(xì)胞相比,藥物濃度為為890 μg/mL時,Hela細(xì)胞抑制率為51.16%。當(dāng)最高藥物濃度達(dá)到1500 μg/mL時,Hela細(xì)胞抑制率為82.18%。相同作用時間增加給藥濃度,細(xì)胞抑制率明顯上升。結(jié)果表明,洋甘菊提取物對Hela細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。其中,IC50為890 μg/mL,對Hela細(xì)胞抑制率為51.16%。同時,將DMSO以完全培養(yǎng)液稀釋后,DMSO的含量同給藥組,經(jīng)實驗觀察,DMSO對照組各濃度對細(xì)胞無明顯抑制作用,并與正常組接近。

        3.2Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察參照相關(guān)文獻(xiàn)[6],觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,見圖2。

        4討論

        本研究采用CCK-8法測定細(xì)胞存活率,結(jié)果表明,洋甘菊提取物可明顯抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。本實驗對Hela細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,Hela細(xì)胞的存活率隨洋甘菊提取物給藥濃度的增加而減?。痪C上所述,洋甘菊提取物能夠抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。

        洋甘菊中含多種活性成分,最為重要成分的是黃酮類成分及其苷類成分,主要有芹菜素、木犀草素和槲皮素、木犀草苷等[7-8],蘭衛(wèi)等[9-10]測定了芹苷元-7-葡萄糖苷和總皂苷的含量。

        胡繼松等[11]研究了芹菜中五種成分對肝癌細(xì)胞株HepG2、白血病細(xì)胞株HL-60的抑制效果。結(jié)果表明,芹菜素(98%)和芹菜醇提物(黃酮含量40%)樣品對HepG2和HL-60有一定的抑制作用,而試驗中芹菜粗黃酮(黃酮含量70%)、芹菜苷(98%)、3-甲氧基芹菜苷(98%)對HepG2和HL-60這兩種腫瘤細(xì)胞均無明顯抑制效果。

        天然藥物通過多種途徑對腫瘤進(jìn)行預(yù)防和治療,抗氧化作用是途徑之一[12]。韓松林等報道了洋甘菊具有抗氧化作用[13]。夏娜等報道了洋甘菊中多糖與黃酮粗提物抗氧化及抑制亞硝化作用[14]。由于洋甘菊多成分,多靶點的特點,其提取物抗腫瘤作用機(jī)制廣泛,洋甘菊抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,其抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖作用的“藥—效”對應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步明確。

        參考文獻(xiàn):

        [1]新疆衛(wèi)生廳.維吾爾藥標(biāo)準(zhǔn)(上冊)[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1993:255.

        [2]楊彥松,潘浪勝.洋甘菊中黃酮類成分的分離與結(jié)構(gòu)確定[J].應(yīng)用化工,2008,37(6):696-697.

        [3]陳麗春,毛建衛(wèi),龔金炎.洋甘菊中芹菜苷提取工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25:986-989.

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        [10]蘭衛(wèi),郭玉婷,耿 直,等.德國洋甘菊花序中總皂苷的含量測定[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,37(3):315-316.

        [11]胡繼松,陳靜萍,陳亮,等.芹菜黃酮類物質(zhì)降壓降脂及抗腫瘤藥理活性篩選[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,(11):9-12.

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        [13]韓松林,李新霞,勉強(qiáng)輝,等.薄層生物自顯影技術(shù)比較新疆2種洋甘菊抗氧化活性[J].中國中藥雜志,2013,38(2):193-198.

        [14]夏娜,陶海燕,趙麗鳳.洋甘菊中多糖與黃酮粗提物抗氧化及抑制亞硝化作用研究[J].食品工業(yè),2014,35(11):293-295.

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