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        四川省十五個(gè)桑樹主栽品種SRAP分子標(biāo)記分析

        2016-05-14 13:38:15張楠丁祥錢葉危玲黃蓋群
        南方農(nóng)業(yè)·下旬 2016年5期
        關(guān)鍵詞:遺傳多樣性桑樹四川省

        張楠 丁祥 錢葉 危玲 黃蓋群

        摘 要 利用SRAP分子標(biāo)記研究了四川省15個(gè)主栽桑樹品種的遺傳多樣性,探討其的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),明晰其種質(zhì)的親緣關(guān)系。對(duì)擴(kuò)增后的條帶進(jìn)行測(cè)序,利用DNAMAN分析軟件分析15個(gè)品種的遺傳關(guān)系,15份品種可被分為4大類。結(jié)果表明,SRAP標(biāo)記技術(shù)在評(píng)價(jià)四川省15個(gè)主栽桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面具有很好的適用性,可為桑樹種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的建立及品種間鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

        關(guān)鍵詞 桑樹;SRAP分子標(biāo)記;遺傳多樣性;四川省

        中圖分類號(hào):S888 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1673-890X(2016)15--02

        我國(guó)是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一[1],栽桑歷史悠久。我國(guó)桑樹育種工作者從20世紀(jì)30年代開始進(jìn)行桑品種的選種工作,截止目前,我國(guó)共保存桑樹種質(zhì)資源近3 000余份,分屬15個(gè)桑種及4個(gè)變種,其中栽培種5個(gè),野生種10個(gè),是世界上桑種最多的國(guó)家。

        開展對(duì)桑樹不同品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究,對(duì)桑樹種質(zhì)量資源收集、核心種質(zhì)保存及新品種選育均具有重要意義。本研究通過從桑樹幼嫩葉片中提取基因組DNA,采用SRAP技術(shù)對(duì)15個(gè)桑品種的遺傳背景和遺傳關(guān)系進(jìn)行分析鑒定,從DNA水平上對(duì)桑樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行鑒定及核心種質(zhì)的確定,為桑樹品種重要農(nóng)藝性狀基因的發(fā)掘與利用提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        實(shí)驗(yàn)材料為保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所桑樹種質(zhì)資源圃的地方種質(zhì)資源15份。2015年7月上旬采取15個(gè)四川省主要栽培品種健壯、無病蟲害植株的幼嫩葉片10 g左右裝入50 mL離心管中,及時(shí)編號(hào)裝入冷藏采樣箱暫存,保存于-80 ℃超低溫冷凍冰箱,取樣應(yīng)在上午氣溫未升高,即09:00前完成。

        1.2 DNA提取

        DNA提取采用從北京天根生物技術(shù)有限公司所購買的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行桑葉DNA的提取。

        1.3 SRAP引物

        SRAP序列來自加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC),引物合成于深圳華大基因科技服務(wù)有限公司。

        1.4 PCR擴(kuò)增

        SRAP-PCR反應(yīng)體系25 ul,包括40 ng模板DNA、1 ul引物(10 ng/ul)、1UTaq DNA聚合酶、2.5 ul10×PCR buffer和0.5 uldNTPs(10 mmol/L),ddH2O補(bǔ)足至25 ul。

        SRAP-PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,35℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共5個(gè)循環(huán);94℃變性1 min,50 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存[2,3]。所用PCR儀為美國(guó)所產(chǎn)BIO-RAD T100 Thermal Cycler。擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠(通過提高瓊脂糖濃度使得條帶分散顯得更清晰)(含0.5 ug/L Gold ViewⅡ型核酸染料)電泳進(jìn)行檢測(cè),并使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        50對(duì)SRAP引物對(duì)桑樹總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中5對(duì)引物能夠擴(kuò)增出得到穩(wěn)定,清晰并且容易計(jì)數(shù)的條帶,在這5對(duì)引物中挑選一對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行條帶回收測(cè)序,本次實(shí)驗(yàn)選用的是第11號(hào)SRAP引物進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行比較分析,鑒定這15個(gè)品種間的遺傳關(guān)系,并對(duì)其進(jìn)行分類。

        2 結(jié)果與分析

        以15個(gè)桑品種SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),對(duì)11號(hào)引物擴(kuò)增所得條帶進(jìn)行回收并且測(cè)序。利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示,SRAP可將這15個(gè)桑品種分為四大類,其中川7637單獨(dú)為一類,即第一大類;臺(tái)灣果桑和川826為一大類,即第二大類;農(nóng)桑14號(hào),湘7920,川桑48-3,川桑83-5,新之一瀨,實(shí)鈷11-6,蜀葚1號(hào),川7431,川桑98-1,油桑,川桑83-6為一大類,即第三大類;湖桑32號(hào)單位為一大類,即第四大類。

        3 結(jié)論與討論

        SRAP標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR水平上發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記技術(shù),由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來[4]。而一個(gè)物種的多樣性主要包括遺傳多樣性,但是其會(huì)受到諸多因素的影響,如地理分布、氣候變化、物種的遺傳變異和進(jìn)化地位等。本研究利用50條SRAP引物種篩選得到5條多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的引物,對(duì)15個(gè)桑種總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),選取其中一條引物擴(kuò)增所得條帶進(jìn)行測(cè)序分析(本實(shí)驗(yàn)所選引物為第11號(hào)引物),測(cè)序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,在測(cè)序水平上SRAP11可將這15個(gè)引物分為四個(gè)大類,每大類中同一生態(tài)環(huán)境、靠近或同在一個(gè)地理位置的資源,親緣關(guān)系越近,遺傳距離也就更近。結(jié)果顯示,本研究所選桑種種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較豐富,而經(jīng)過篩選所得的引物在評(píng)價(jià)桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面有很好的適用性。

        參考文獻(xiàn)

        [1]陳仁芳,張澤,唐洲,等.桑屬ITS、trnL-F、rps16序列與進(jìn)化分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(44):1553-1561.

        [2]林強(qiáng),邱長(zhǎng)玉,趙衛(wèi)國(guó),等.32份廣東桑類型桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP標(biāo)記分析[J].蠶業(yè)科學(xué),2011(37):373-379.

        [3]王華忠,吳則東,王曉武,等.利用SRAP與SSR標(biāo)記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學(xué)報(bào),2008(34):37-46.

        [4]林強(qiáng),朱方容,邱長(zhǎng)玉,等.廣西桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011(42):358-363.

        (責(zé)任編輯:趙中正)

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