張楠 丁祥 錢葉 危玲 黃蓋群

摘 要 利用SRAP分子標(biāo)記研究了四川省15個主栽桑樹品種的遺傳多樣性，探討其的基因結(jié)構(gòu)特點，明晰其種質(zhì)的親緣關(guān)系。對擴增后的條帶進(jìn)行測序，利用DNAMAN分析軟件分析15個品種的遺傳關(guān)系，15份品種可被分為4大類。結(jié)果表明，SRAP標(biāo)記技術(shù)在評價四川省15個主栽桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面具有很好的適用性，可為桑樹種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的建立及品種間鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 桑樹；SRAP分子標(biāo)記；遺傳多樣性；四川省

中圖分類號：S888 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）15--02

我國是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一[1]，栽桑歷史悠久。我國桑樹育種工作者從20世紀(jì)30年代開始進(jìn)行桑品種的選種工作，截止目前，我國共保存桑樹種質(zhì)資源近3 000余份，分屬15個桑種及4個變種，其中栽培種5個，野生種10個，是世界上桑種最多的國家。

開展對桑樹不同品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究，對桑樹種質(zhì)量資源收集、核心種質(zhì)保存及新品種選育均具有重要意義。本研究通過從桑樹幼嫩葉片中提取基因組DNA，采用SRAP技術(shù)對15個桑品種的遺傳背景和遺傳關(guān)系進(jìn)行分析鑒定，從DNA水平上對桑樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行鑒定及核心種質(zhì)的確定，為桑樹品種重要農(nóng)藝性狀基因的發(fā)掘與利用提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所桑樹種質(zhì)資源圃的地方種質(zhì)資源15份。2015年7月上旬采取15個四川省主要栽培品種健壯、無病蟲害植株的幼嫩葉片10 g左右裝入50 mL離心管中，及時編號裝入冷藏采樣箱暫存，保存于-80 ℃超低溫冷凍冰箱，取樣應(yīng)在上午氣溫未升高，即09：00前完成。

1.2 DNA提取

DNA提取采用從北京天根生物技術(shù)有限公司所購買的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行桑葉DNA的提取。

1.3 SRAP引物

SRAP序列來自加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC），引物合成于深圳華大基因科技服務(wù)有限公司。

1.4 PCR擴增

SRAP-PCR反應(yīng)體系25 ul，包括40 ng模板DNA、1 ul引物（10 ng/ul）、1UTaq DNA聚合酶、2.5 ul10×PCR buffer和0.5 uldNTPs（10 mmol/L），ddH2O補足至25 ul。

SRAP-PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5個循環(huán)；94℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[2，3]。所用PCR儀為美國所產(chǎn)BIO-RAD T100 Thermal Cycler。擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠（通過提高瓊脂糖濃度使得條帶分散顯得更清晰）（含0.5 ug/L Gold ViewⅡ型核酸染料）電泳進(jìn)行檢測，并使用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照記錄。

1.5 數(shù)據(jù)分析

50對SRAP引物對桑樹總DNA進(jìn)行PCR擴增，其中5對引物能夠擴增出得到穩(wěn)定，清晰并且容易計數(shù)的條帶，在這5對引物中挑選一對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行條帶回收測序，本次實驗選用的是第11號SRAP引物進(jìn)行測序分析。測序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行比較分析，鑒定這15個品種間的遺傳關(guān)系，并對其進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

以15個桑品種SRAP-PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生的條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對11號引物擴增所得條帶進(jìn)行回收并且測序。利用DNAMAN軟件對測序后的結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，SRAP可將這15個桑品種分為四大類，其中川7637單獨為一類，即第一大類；臺灣果桑和川826為一大類，即第二大類；農(nóng)桑14號，湘7920，川桑48-3，川桑83-5，新之一瀨，實鈷11-6，蜀葚1號，川7431，川桑98-1，油桑，川桑83-6為一大類，即第三大類；湖桑32號單位為一大類，即第四大類。

3 結(jié)論與討論

SRAP標(biāo)記技術(shù)是一種基于PCR水平上發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記技術(shù)，由美國加州大學(xué)蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來[4]。而一個物種的多樣性主要包括遺傳多樣性，但是其會受到諸多因素的影響，如地理分布、氣候變化、物種的遺傳變異和進(jìn)化地位等。本研究利用50條SRAP引物種篩選得到5條多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的引物，對15個桑種總DNA進(jìn)行擴增反應(yīng)，選取其中一條引物擴增所得條帶進(jìn)行測序分析（本實驗所選引物為第11號引物），測序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在測序水平上SRAP11可將這15個引物分為四個大類，每大類中同一生態(tài)環(huán)境、靠近或同在一個地理位置的資源，親緣關(guān)系越近，遺傳距離也就更近。結(jié)果顯示，本研究所選桑種種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較豐富，而經(jīng)過篩選所得的引物在評價桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面有很好的適用性。

參考文獻(xiàn)

[1]陳仁芳，張澤，唐洲，等.桑屬ITS、trnL-F、rps16序列與進(jìn)化分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（44）：1553-1561.

[2]林強，邱長玉，趙衛(wèi)國，等.32份廣東桑類型桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP標(biāo)記分析[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011（37）：373-379.

[3]王華忠，吳則東，王曉武，等.利用SRAP與SSR標(biāo)記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學(xué)報，2008（34）：37-46.

[4]林強，朱方容，邱長玉，等.廣西桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011（42）：358-363.

（責(zé)任編輯：趙中正）