張楠 丁祥 錢葉 危玲 黃蓋群
摘 要 利用SRAP分子標記研究了四川省15個主栽桑樹品種的遺傳多樣性,探討其的基因結(jié)構(gòu)特點,明晰其種質(zhì)的親緣關(guān)系。對擴增后的條帶進行測序,利用DNAMAN分析軟件分析15個品種的遺傳關(guān)系,15份品種可被分為4大類。結(jié)果表明,SRAP標記技術(shù)在評價四川省15個主栽桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面具有很好的適用性,可為桑樹種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的建立及品種間鑒定提供科學依據(jù)。
關(guān)鍵詞 桑樹;SRAP分子標記;遺傳多樣性;四川省
中圖分類號:S888 文獻標志碼:A 文章編號:1673-890X(2016)15--02
我國是桑樹遺傳多樣性的起源中心之一[1],栽桑歷史悠久。我國桑樹育種工作者從20世紀30年代開始進行桑品種的選種工作,截止目前,我國共保存桑樹種質(zhì)資源近3 000余份,分屬15個桑種及4個變種,其中栽培種5個,野生種10個,是世界上桑種最多的國家。
開展對桑樹不同品種的親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究,對桑樹種質(zhì)量資源收集、核心種質(zhì)保存及新品種選育均具有重要意義。本研究通過從桑樹幼嫩葉片中提取基因組DNA,采用SRAP技術(shù)對15個桑品種的遺傳背景和遺傳關(guān)系進行分析鑒定,從DNA水平上對桑樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性進行鑒定及核心種質(zhì)的確定,為桑樹品種重要農(nóng)藝性狀基因的發(fā)掘與利用提供理論依據(jù)和應用基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
實驗材料為保存于四川省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所桑樹種質(zhì)資源圃的地方種質(zhì)資源15份。2015年7月上旬采取15個四川省主要栽培品種健壯、無病蟲害植株的幼嫩葉片10 g左右裝入50 mL離心管中,及時編號裝入冷藏采樣箱暫存,保存于-80 ℃超低溫冷凍冰箱,取樣應在上午氣溫未升高,即09:00前完成。
1.2 DNA提取
DNA提取采用從北京天根生物技術(shù)有限公司所購買的植物基因組DNA提取試劑盒進行桑葉DNA的提取。
1.3 SRAP引物
SRAP序列來自加拿大哥倫比亞大學(UBC),引物合成于深圳華大基因科技服務有限公司。
1.4 PCR擴增
SRAP-PCR反應體系25 ul,包括40 ng模板DNA、1 ul引物(10 ng/ul)、1UTaq DNA聚合酶、2.5 ul10×PCR buffer和0.5 uldNTPs(10 mmol/L),ddH2O補足至25 ul。
SRAP-PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,35℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共5個循環(huán);94℃變性1 min,50 ℃復性1 min,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存[2,3]。所用PCR儀為美國所產(chǎn)BIO-RAD T100 Thermal Cycler。擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠(通過提高瓊脂糖濃度使得條帶分散顯得更清晰)(含0.5 ug/L Gold ViewⅡ型核酸染料)電泳進行檢測,并使用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行拍照記錄。
1.5 數(shù)據(jù)分析
50對SRAP引物對桑樹總DNA進行PCR擴增,其中5對引物能夠擴增出得到穩(wěn)定,清晰并且容易計數(shù)的條帶,在這5對引物中挑選一對PCR擴增產(chǎn)物進行條帶回收測序,本次實驗選用的是第11號SRAP引物進行測序分析。測序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進行比較分析,鑒定這15個品種間的遺傳關(guān)系,并對其進行分類。
2 結(jié)果與分析
以15個桑品種SRAP-PCR擴增反應產(chǎn)生的條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)數(shù)據(jù),對11號引物擴增所得條帶進行回收并且測序。利用DNAMAN軟件對測序后的結(jié)果進行比對分析,結(jié)果顯示,SRAP可將這15個桑品種分為四大類,其中川7637單獨為一類,即第一大類;臺灣果桑和川826為一大類,即第二大類;農(nóng)桑14號,湘7920,川桑48-3,川桑83-5,新之一瀨,實鈷11-6,蜀葚1號,川7431,川桑98-1,油桑,川桑83-6為一大類,即第三大類;湖桑32號單位為一大類,即第四大類。
3 結(jié)論與討論
SRAP標記技術(shù)是一種基于PCR水平上發(fā)展起來的新型分子標記技術(shù),由美國加州大學蔬菜系Li與Quiros博士于2001年在蕓薹屬作物開發(fā)出來[4]。而一個物種的多樣性主要包括遺傳多樣性,但是其會受到諸多因素的影響,如地理分布、氣候變化、物種的遺傳變異和進化地位等。本研究利用50條SRAP引物種篩選得到5條多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的引物,對15個桑種總DNA進行擴增反應,選取其中一條引物擴增所得條帶進行測序分析(本實驗所選引物為第11號引物),測序所得結(jié)果采用DNAMAN軟件進行數(shù)據(jù)分析,在測序水平上SRAP11可將這15個引物分為四個大類,每大類中同一生態(tài)環(huán)境、靠近或同在一個地理位置的資源,親緣關(guān)系越近,遺傳距離也就更近。結(jié)果顯示,本研究所選桑種種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)較豐富,而經(jīng)過篩選所得的引物在評價桑樹品種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性等方面有很好的適用性。
參考文獻
[1]陳仁芳,張澤,唐洲,等.桑屬ITS、trnL-F、rps16序列與進化分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2011(44):1553-1561.
[2]林強,邱長玉,趙衛(wèi)國,等.32份廣東桑類型桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP標記分析[J].蠶業(yè)科學,2011(37):373-379.
[3]王華忠,吳則東,王曉武,等.利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜的遺傳多樣性[J].作物學報,2008(34):37-46.
[4]林強,朱方容,邱長玉,等.廣西桑樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SRAP分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報,2011(42):358-363.
(責任編輯:趙中正)