楊 棟,陳章林,肖姜伶,周作瓊,張 平,彭夕洋,鄭 瀾,湯長發(fā)

(湖南師范大學 體育學院,中國湖南 長沙 410081)

斑馬魚具有基因組與人類基因組相似度高、基因編輯簡單、飼養(yǎng)方便等特點,而且其水環(huán)境適合多種運動方案和高強度運動訓練的開展,是一種新興的研究運動干預效果的理想模型[1]。運動方案的設(shè)計需要考慮運動強度、運動頻率、運動時間和能量供應(yīng)方式。研究表明,不同的運動干預方案對斑馬魚機能的影響截然不同,合理的運動方案對實現(xiàn)預期的運動干預效果至關(guān)重要[2]。建立斑馬魚有氧運動能力評估方法和有氧/無氧運動訓練判斷方法,有利于了解斑馬魚能承受的運動強度及運動時能量供應(yīng)狀態(tài),為精確制定斑馬魚運動干預方案奠定基礎(chǔ)。

臨界游泳速度是魚類測試方案中達到的最大游泳速度,體現(xiàn)了魚類在持續(xù)的游泳活動中提供能量的最大能力,可作為魚類游泳能力和代謝性能的評估指標[3]。斑馬魚臨界游泳速度易受多環(huán)芳烴和2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(TCCD)等毒性物質(zhì)的影響,常被用于水質(zhì)監(jiān)控和藥物毒性檢測[3～4]。在臨界游泳速度測試中,魚類的實時耗氧量與游泳速度呈正相關(guān)[5～7],魚類的最大耗氧量類似于人類的最大攝氧量,反映了魚類最高代謝率[3],可作為評估有氧運動能力的重要指標[8～9]。目前,已有研究通過Loligo泳道呼吸儀,設(shè)計了成年斑馬魚的耗氧量測定方案[5～7],但由于不同年齡斑馬魚的體長、體重和基礎(chǔ)代謝速率有差異,以往研究未探討耗氧量測定方案在不同年齡階段斑馬魚中測試的可行性,以及耗氧量與游泳速度之間的關(guān)系。衡量有氧運動能力的另一個經(jīng)典指標是血乳酸閾。血液中乳酸濃度隨運動強度的增加而增加,當運動強度達到某一負荷時,血乳酸濃度急劇增加的拐點稱為乳酸閾,表示機體從有氧運動向無氧運動的轉(zhuǎn)折點[10]。然而,關(guān)于斑馬魚血乳酸閾的測定方法目前尚未有報道,其血乳酸水平與運動強度的關(guān)系也有待研究?；诖?本文擬探究通過測量最大耗氧量、臨界游泳速度、血乳酸閾等指標來綜合評估斑馬魚有氧運動能力的方法,以期為建立水生生物有氧運動能力評價指標體系奠定基礎(chǔ)。

本研究設(shè)計了泳道呼吸儀耗氧量測量方案,該方案適用于測量青年、中年和老年斑馬魚的最大耗氧量;同時,設(shè)計了乳酸閾檢測方法,實現(xiàn)了不同游泳速度下斑馬魚血乳酸的連續(xù)測定,分析了斑馬魚血乳酸水平與運動強度的關(guān)系。本文建立的斑馬魚耗氧量和血乳酸閾測定方案,為有效評估斑馬魚有氧運動能力提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器設(shè)備

野生型斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心,飼養(yǎng)條件為水溫28℃、光照14 h/d,每天投喂豐年蝦3次。研究中使用的儀器主要包括丹麥Loligo泳道呼吸儀和德國EKF公司的微量血乳酸檢測儀,前者用于測定臨界游泳速度(Ucrit)和耗氧量(MO2),后者用于測定血乳酸值。其他材料和試劑包括:斑馬魚采血針(北京市紅星區(qū)醫(yī)療設(shè)備廠)、Lactate Scout試紙片(EKF公司,德國)、三卡因麻醉劑(Sigma公司,美國)和肝素鈉(5 mg/mL,生工生物工程上海股份有限公司)等。

1.2 斑馬魚臨界游泳速度與相對臨界游泳速度的測定

1.3 斑馬魚耗氧量測定

1.4 單位距離能耗與最優(yōu)游泳速度的計算

單位距離能耗(cost of transport,COT)表示維持標準代謝率、克服阻力并以特定水速加速的能量消耗,可用于確定斑馬魚運動單位距離所需的能量。參照Palstra等[11]魚類COT模型:COT=實時耗氧量/實時游泳速度。根據(jù)COT與遞增速度節(jié)點做圖,經(jīng)回歸分析推導COT與速度節(jié)點的方程[11]。依據(jù)Palstra等[12]定義的最優(yōu)游泳速度(optimal swimming speed,Uopt):每單位距離游泳時最低的耗氧量或最低COT所對應(yīng)的速度,可推算出Uopt是COT方程的一階導數(shù)等于零時所對應(yīng)的速度。

1.5 斑馬魚血乳酸閾測定

以斑馬魚臨界游泳速度的0%、20%、40%、60%、80%、100%設(shè)置梯度游泳運動強度節(jié)點,在每個運動強度節(jié)點運動5 min。使用微量采血針進行尾靜脈取血,并使用微量血乳酸檢測儀測量血乳酸,繪制不同運動強度節(jié)點的斑馬魚血乳酸值曲線圖,從而求得斑馬魚的血乳酸閾。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差(x±s)表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0進行獨立樣本T檢驗,顯著性水平為P＜0.05。采用Graphpad Prism 9.1.0制圖。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡斑馬魚的最大耗氧量

斑馬魚的最大耗氧量(MO2max)隨著年齡的增長呈現(xiàn)下降的趨勢(圖1),3月齡斑馬魚的MO2max高于8月齡(P＜0.05)和14月齡斑馬魚(P＜0.01);8月齡斑馬魚的MO2max較14月齡斑馬魚高,且差異具有顯著性(P＜0.05)。

圖1 3、8和14月齡斑馬魚的最大耗氧量Fig.1 Maximum oxygen consumption(MO2max)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.2 不同月齡斑馬魚的相對臨界游泳速度

檢測結(jié)果顯示,3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚的 Ucrit-r分別是(13.84±0.73)BL/s、(14.05±0.35)BL/s和(11.49±0.42)BL/s(圖 2)。其中,3 月齡和 8月齡斑馬魚的Ucrit-r無顯著差異,3月齡和8月齡斑馬魚的Ucrit-r顯著高于14月齡斑馬魚的Ucrit-r(P＜0.01,P＜0.05),表明隨著年齡的增長,8月齡之后斑馬魚的運動能力下降顯著。

圖2 3、8和14月齡斑馬魚的相對臨界游泳速度Fig.2 Relative critical swimming speed(Ucrit-r)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.3 不同月齡斑馬魚的耗氧量、單位距離能耗和最優(yōu)游泳速度

圖3 3月齡斑馬魚耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=8)Fig.3 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 3-month-old zebrafish(n=8)

圖4 8月齡斑馬魚耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=7)Fig.4 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 8-month-old zebrafish(n=7)

圖5 14月齡斑馬魚耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=3)Fig.5 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 14-month-old zebrafish(n=3)

2.4 不同月齡斑馬魚的血乳酸閾

不同月齡斑馬魚的血乳酸檢測結(jié)果顯示,隨著運動強度的增加,血乳酸濃度呈現(xiàn)上升趨勢。在低強度運動中,斑馬魚的血乳酸濃度基本保持平穩(wěn)或呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。3月齡斑馬魚的血乳酸濃度隨著運動強度的增加,在60%的Ucrit運動強度后急劇上升,其血乳酸閾為(2.98±0.86)mmol/L。8月齡斑馬魚和14月齡斑馬魚的血乳酸濃度在80% Ucrit運動強度后急劇上升,血乳酸閾分別為(2.47±0.29)mmol/L 和(3.83±0.25)mmol/L(圖 6)。在相同的Ucrit百分比下,14月齡斑馬魚的血乳酸閾值高于8月齡斑馬魚。

圖6 3、8和14月齡斑馬魚血乳酸在不同訓練速度下的變化Fig.6 Blood lactic acid change of 3-,8-,and 14-monthold zebrafish under different training speeds

3 討論

有氧運動能力是評估斑馬魚機能狀態(tài)的指標,作為監(jiān)控手段被廣泛應(yīng)用于運動醫(yī)學[13～14]、環(huán)境監(jiān)測[3,15]、遺傳[16]和藥理[17～19]等領(lǐng)域的研究。本文建立了基于最大耗氧量和血乳酸閾評估斑馬魚有氧運動能力的方法。針對3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚有氧運動能力的檢測數(shù)據(jù)說明,該方法體系對各年齡階段斑馬魚具有可行性,為涉及有氧運動能力檢測的斑馬魚模型應(yīng)用研究奠定了方法學基礎(chǔ)。

評估有氧運動能力是合理設(shè)計斑馬魚運動方案的重要前提。運動方案中設(shè)計的運動強度過大,將會導致斑馬魚病理性心肌肥大[20]、免疫力降低、代謝重編程[21],促進炎癥的發(fā)生[22],影響運動干預效果的判斷。Palstra等[11]最早對3月齡斑馬魚在不同游泳速度下的耗氧情況進行了研究。斑馬魚的有氧運動能力與其年齡及體質(zhì)差異密切相關(guān),我們發(fā)現(xiàn)Palstra制定的測定方案不適合中、老年斑馬魚的運動耗氧量測定,對不同年齡斑馬魚的有氧運動能力測定有局限性。因此,在借鑒國外耗氧量測定方法的基礎(chǔ)上,本研究針對不同年齡階段斑馬魚的體質(zhì)特征對測試方案進行了優(yōu)化,經(jīng)過大量前期試驗,最終確定了本實驗檢測斑馬魚耗氧量的方法。本實驗確定的檢測斑馬魚耗氧量的方法可適應(yīng)于不同年齡段的斑馬魚耗氧量測試,結(jié)果曲線基本符合國外關(guān)于斑馬魚耗氧量的測試結(jié)果。通過測定3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚的有氧運動能力,經(jīng)回歸分析,我們推導出3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚的MO2及COT方程,并獲得這3種年齡階段斑馬魚的Uopt,驗證了耗氧量測定方法的科學性和可行性。

乳酸閾是界定機體在運動過程中,由中強度的有氧運動為主向高強度無氧運動為主的過渡點,被廣泛應(yīng)用于人類有氧能力的評估。與簡單、易行的人類血乳酸檢測不同,斑馬魚由于血管小、血量少、取血難,遞增運動不同節(jié)點下血乳酸的檢測是關(guān)鍵技術(shù)難題。目前,國內(nèi)外關(guān)于利用血乳酸檢測斑馬魚有氧運動能力及血乳酸水平與運動強度關(guān)系的研究尚屬空白。本研究利用微量采血針采集斑馬魚尾部靜脈血液,按照斑馬魚血乳酸檢測方法,測定血乳酸的水平,首次繪制了斑馬魚的運動血乳酸曲線,發(fā)現(xiàn)3月齡斑馬魚的血乳酸閾出現(xiàn)在臨界游泳速度的60%左右,而8月齡和14月齡斑馬魚的血乳酸閾在臨界游泳速度的80%左右出現(xiàn)。從結(jié)果上看,3月齡斑馬魚的有氧運動能力可能要比8月齡和14月齡斑馬魚的有氧運動能力差,但實際而言,3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚在60% Ucrit所對應(yīng)的實際速度是不一樣的,所以本文沒有對不同年齡段斑馬魚血乳酸閾的變化趨勢進行分析,只是探討3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚的血乳酸閾拐點出現(xiàn)的速度占Ucrit的百分比,為斑馬魚有氧和無氧運動干預方案的界定與制定提供參考。

綜上所述,本研究確定的最大耗氧量和血乳酸閾的測試方法,可有效評估斑馬魚有氧運動能力和最佳游泳速度,為斑馬魚模型在運動醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測、遺傳和藥理等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了有氧運動能力的精準評估手段。