劉然

【摘 要】微生物污垢形成是極其復(fù)雜的動量、能量和質(zhì)量傳遞過程，是多影響因素共同作用的結(jié)果，具有普遍性、非線性、強時變性和強匹配性等特點。本文以粘液形成菌為菌種，研究高頻電場對微生物污垢的影響，并通過高頻電場對比試驗進行蛋白質(zhì)組學(xué)實驗，找出致垢蛋白和致垢基因，并通過基因測序基因?qū)χ鹿富蜻M行準確定位，最后建立起致垢微生物基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，同時分析貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型。

【關(guān)鍵詞】基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 粘液形成菌 貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型

1 引言

粘液形成菌是水中懸浮的粘泥的異養(yǎng)菌，這類細菌具有粘附力，同時分泌出粘液狀物質(zhì)，能形成胞外高聚物（EPS）。EPS具有粘性，使得細菌容易附著在各種顆粒物質(zhì)表面，如粘土、石膏、腐殖質(zhì)和碎片等。由于這一類細菌都是好氧細菌，當其在金屬表面進行生命活動時，就會在金屬表面形成陽極區(qū)和陰極區(qū)，從而構(gòu)成氧濃差或其它濃度差電池，對金屬的局部造成腐蝕。此外，此類細菌是好氧型，能把生物膜中的氧離子消耗，使其空間為無氧環(huán)境，為厭氧性細菌的生存創(chuàng)造條件，進而導(dǎo)致混合型細菌的腐蝕。而且這類細菌能促使水質(zhì)惡化、增加水體粘度、破壞油層和腐蝕設(shè)備等多重副效應(yīng)[1]。

2 基因組測序?qū)嶒?/p>

2.1測序流程

文庫構(gòu)建 →→ 橋式PCR →→ Illumina MiSeq測序

2.2 流程說明

2.2.1文庫構(gòu)建：

收集純化基因組DNA[2]；利用Covaris進行基因組DNA片段化，構(gòu)建基因組測序文庫；連接A & B接頭；篩選去除接頭自連片段；瓊脂糖凝膠電泳進行片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

2.2.2橋式PCR

DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成橋；PCR擴增，產(chǎn)生DNA簇。

2.2.3 Illumina MiSeq測序

加入改造過的DNA聚合酶，每次循環(huán)只摻入單種堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

3 蛋白質(zhì)組測序?qū)嶒?/p>

3.1致垢蛋白質(zhì)實驗

實驗流程：

水化上樣（ 被動上樣）：從冰箱里拿出IPG膠條，常溫下保持10min以上。在水化盤槽的邊上從左向右直線添加樣品，靠近水化盤槽兩個端邊各約1cm 不加樣，中間加入樣品液體必須需要連續(xù)。將水化盤中樣品溶液上慢慢置于上朝下IPG膠條膠面。放著 45-60min 膠條吸收將絕大部分樣品，沿著膠條輕輕的放上礦物油，放等電聚焦儀在-20℃左右水化12-16小時。

第一向 等電聚焦：將紙電極放在聚焦盤的正負電極上，加上ddH2O5-8μl濕潤。將聚焦盤中放入膠面朝下IPG膠條，膠條的負極（標有-）對應(yīng)在聚焦盤的負極，保證電極和膠條密切接觸。均勻覆蓋2-3ml礦物油在每根膠條上。使正、負極對好，再蓋好蓋子。設(shè)定等電聚焦程序。結(jié)束聚焦的膠條，馬上進行平衡、第二向凝膠SDS-PAGE電泳。

第二向SDS-PAGE電泳：配制質(zhì)量分數(shù)13%的丙烯酰胺凝膠。等凝固凝膠后，除去分離膠表面的乙醇、水飽和正丁醇或MilliQ水，用MilliQ水洗洗。組成膠條平衡緩沖液1。將MilliQ水浸濕一張厚濾紙，將過多水分擠去，再直接放在膠條上，慢慢吸盡膠條上的多余樣品和礦物油，組成膠條平衡緩沖液2。在首先的結(jié)束平衡搖動后，拿出膠條使它立在濾紙上去除過多的液體，放進平衡緩沖液2里，用濾紙吸掉SDS-PAGE膠上部分玻璃間過多的溶液，加熱溶解瓊脂糖封膠液。在量筒中放入100mlTGS電泳緩沖液。第二次結(jié)束平衡后，拿鑷子固定住膠條一端讓膠面全部沉在1×電泳緩沖液中數(shù)次漂洗。將膠條背面面朝玻璃板，慢慢置于長玻板上面，添加低熔點的瓊脂糖封膠液。用一定尺寸的膠片，慢慢地向下推膠條，讓它和完全接觸聚丙烯酰胺凝膠膠面。放上大約5分鐘，凝固低熔點瓊脂糖封膠液。擰開二向電泳制冷儀，調(diào)整溫度大約為15℃。電泳結(jié)束后，慢慢挪動兩層玻璃，拿出凝膠，且劃線作為記號之后染色和掃描。

3.2致垢蛋白質(zhì)分析

選出靜態(tài)對比試驗中的細菌[3]，對它們進行裂解，分離提純它們的蛋白質(zhì)，并運用蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)知識對它們進行2-DE電泳分析，找出差異蛋白質(zhì)。同時對差異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析，找出致垢蛋白質(zhì)序列。盡量分析各種致垢蛋白質(zhì)對金屬腐蝕的協(xié)同作用。這些方面牽扯到蛋白質(zhì)組學(xué)的表達水平和蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互影響，翻譯后修飾等等內(nèi)容，需要的技術(shù)是雙向凝膠電泳（2-DE）、質(zhì)譜技術(shù)（MS）等。

4 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型

貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型：貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型[4]是用隱馬爾科夫鏈和向無環(huán)圖來表述變量之間的關(guān)系。在貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型下，構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點表示基因和它的表達水品，邊表示基因之間的調(diào)控關(guān)系，條件概率表用來描述這些調(diào)控關(guān)系。

以貝葉斯算法為基礎(chǔ)，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，并得到給定參數(shù)的條件概率，明確各節(jié)點的因果影響關(guān)系。貝葉斯網(wǎng)絡(luò)是用圖形的形式來表現(xiàn)變量之間的概率依賴關(guān)系，一般包括如下三個步驟：（1）標識影響該領(lǐng)域的變量及其它們的可能值；（2）將變量按某種次序進行排序；（3）給父節(jié)點指派局部概率分布。

參考文獻：

[1] 楊善讓，徐志明，孫靈芳.換熱設(shè)備污垢與對策（第二版）[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[2] Smolen P， Baxter D A， Byrne J H. Modeling transcriptional control in gene networks： Methods，recent result， and future directions. Bulletion of Mathematical Biology， 2000，62：247-292.

[3] R.M坎普.B.威特曼.李博德.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析：制備、鑒定與微量測序[M].北京：科學(xué)出版社，2000

[4] 張宏怡，張軍英.基于因果關(guān)系挖掘的概率基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[J].計算機工程，2007，33（15）：26-28.