李濤 萬譯文 劉登望

摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取錦鯉組織樣品中的DNA，利用針對錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守區(qū)設(shè)計的一對特異性引物、一條特異熒光探針，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，通過對熒光信號的實時監(jiān)測實現(xiàn)對KHV的定量檢測。整個過程快速、簡捷，操作簡單，可對KHV進行快速有效的診斷，具有一定的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：錦鯉皰疹病毒；熒光定量PCR；TaqMan；一步法

中圖分類號：S941.41+9文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0125-04

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一種傳染性疾病。KHV能夠感染錦鯉、鯉魚和剃刀魚，其魚苗、幼魚、成魚均可感染。錦鯉皰疹病毒病多發(fā)于春、秋季，潛伏期兩周左右，魚發(fā)病并出現(xiàn)癥狀24～48 h后開始死亡，2～4 d內(nèi)死亡率可迅速達到80%～100%[1，2]。此病首先在以色列暴發(fā)，接著美國、歐洲（如英國、德國、比利時）及亞洲一些國家均有此病發(fā)生，給錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[3，4]。

錦鯉皰疹病毒顆粒呈球狀，有囊膜，直徑約170～230 nm，其核衣殼為對稱十面體，直徑為100～110 nm，該病毒由31種病毒多肽組成，遺傳物質(zhì)為雙鏈DNA，基因組大小約為277 kb[5，6]。

目前錦鯉皰疹病毒病的檢測方法有電鏡檢測、ELISA、普通PCR和熒光定量PCR等[7]。TaqMan熒光定量PCR是在PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一種特異性熒光探針，該探針為一段寡聚核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5′→3′外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步[8～11]。

鑒于錦鯉皰疹病毒病對養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害，對其進行快速準確的檢測具有重要意義。本研究通過比對兩種不同的核酸提取方法，建立了基于TaqMan熒光定量PCR技術(shù)快速檢測KHV的方法，以期為有效控制錦鯉皰疹病毒病的傳播提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1病毒株

KHV標準毒株VR1592購自北京中原公司。錦鯉細胞系（KF）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和鯉魚皰疹病毒（CHV）核酸由湖南水產(chǎn)科學研究所饋贈。

1.2主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；通用一步法DNA提取液、柱式病毒基因組抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司（簡稱上海生工）；脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）、Taq DNA聚合酶購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司（北京）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯化鉀（KCl）、氯化鎂（MgCl2）、硫酸銨、甘油等購自西隴化工有限公司（廣州）。

1.3引物設(shè)計

查找KHV相關(guān)基因并利用ClustalX2進行序列比對，最后選定TK基因的保守區(qū)設(shè)計引物和探針，使用引物設(shè)計軟件Oligo7。正向引物F1：5′-GCTGGAGCGTCTGTCCT-3′；反向引物F2：5′-ATGGCCACCTTGGACTCTT-3′；TaqMan探針：FAM-5′-ACGCTGCATCGCCGTCAAGCAC-3′-BQ1，擴增長度為90 bp。經(jīng)NCBI網(wǎng)站上的Primer-Blast分析本套引物具有KHV特異性。同時以KHV全長基因組序列（KJ627438）為模板合成含TK基因的質(zhì)粒做為參考品。引物、探針及質(zhì)粒皆由上海生工合成。

1.4TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系（50 μL）包括Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，添加（NH4）2SO4 10 mmol/L和甘油3%增加擴增的特異性和穩(wěn)定性。

引物和探針終濃度的篩選：利用0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L的引物終濃度和0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μmol/L的探針終濃度對樣品進行擴增，篩選引物和探針的最佳濃度。

擴增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，收集熒光信號；4℃保溫。

1.5病毒培養(yǎng)

將KHV 標準毒株VR1592 接種KF 細胞，待出現(xiàn)細胞病變收獲病毒培養(yǎng)液（以下簡稱細胞毒）。

1.6DNA提取方法比較

KHV DNA分別用兩種試劑盒提取并進行對比。

方法一：一步法，利用通用一步法DNA提取液。將約2 μL液體樣品或固體組織研磨液（剪取約20 mg錦鯉腮腺組織，加入200 μL生理鹽水，用玻璃勻漿器充分研磨得到組織研磨液）加入到50 μL提取液中，80℃加熱5 min后，簡短振蕩混勻后取裂解物直接進行PCR。

方法二：柱提法，利用柱式病毒基因組抽提試劑盒。按照試劑盒說明書操作，經(jīng)過蛋白酶K裂解、吸附柱收集、DNA洗脫等步驟，大約需要1 h。

1.7特異性試驗

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法同時對錦鯉皰疹病毒（KHV）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和鯉魚皰疹病毒（CHV） DNA進行擴增，檢測KHV引物和探針的特異性。

1.8敏感性試驗

KHV質(zhì)粒由上海生工合成后，然后按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：每微升質(zhì)?？截悢?shù)=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA序列長度×660）。將質(zhì)粒進行10 倍梯度稀釋，檢測該方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗

取3個批次細胞毒樣本，用一步法提取DNA后進行熒光定量PCR檢測。同一樣本做3個平行檢測。

1.10樣品檢測

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法將30 份細胞培養(yǎng)物與攻毒魚組織樣本進行檢測，同時利用普通PCR進行檢測，比較熒光定量PCR方法的應(yīng)用情況。

2結(jié)果與分析

2.1PCR反應(yīng)體系的建立

最終確定引物、探針終濃度分別為0.1、0.06 μmol/L時能獲得較理想的擴增結(jié)果，濃度增加擴增效果提高不明顯，濃度降低則熒光信號較低。

最終的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，（NH4）2SO4 10 mmol/L，甘油3%，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，正、反向引物各0.1 μmol/L，熒光探針0.06 μmol/L。

2.2兩種DNA提取方法比較

對同一細胞毒運用兩種方法提取DNA，并用熒光定量PCR方法重復(fù)檢測3次。結(jié)果顯示兩種方法無明顯差異（圖1，表1），說明一步法可以提取代柱提法進行KHV DNA提取并進行熒光PCR檢測。

2.3特異性試驗結(jié)果

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法同時檢測KHV、SVCV、IHNV、VHSV和CHV DNA，只有KHV有擴增曲線（圖2），說明該方法具有良好的特異性。

2.4敏感性試驗結(jié)果

將KHV質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，共4個梯度，分別為3×104、3×103、3×102、3×10 拷貝/μL，最低檢測限為30 拷貝/μL（圖3）。以質(zhì)粒濃度30 拷貝/μL為模板進行20次重復(fù)檢測，檢出率為95%，證明該方法檢測KHV具有極高的靈敏度。

2.5重復(fù)性試驗結(jié)果

3個批次細胞毒樣本用一步法分別提取DNA后均分3次進行熒光PCR擴增，結(jié)果（圖4，表2）顯示該方法重復(fù)性較好，變異系數(shù)CV<2.00%。

2.6臨床樣品檢測結(jié)果

采用建立的一步DNA提取法結(jié)合熒光定量PCR方法檢測30份細胞培養(yǎng)物與攻毒魚組織樣本（表3），熒光定量PCR陽性檢出率為96.67%（29/30），普通PCR陽性檢出率為60%（18/30）。兩種方法比較，熒光定量PCR方法檢測KHV具有更高的靈敏度。

3討論與結(jié)論

熒光定量PCR利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析，簡化了檢測過程，重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰，具有廣泛用途[8～11]。

在其它利用熒光定量PCR方法檢測錦鯉皰疹病毒的研究中，DNA提取方法大多采用商業(yè)試劑盒柱提法[3， 6]或經(jīng)典CTAB法[12]。柱提法步驟繁多，耗時長；而經(jīng)典CTAB法所用有機試劑酚、氯仿等可造成環(huán)境污染，對人體危害大。本研究選用的一步法，整個提取過程不包含去蛋白、去RNA及其它次生代謝物的過程，無需有機溶劑抽提，無需無水乙醇沉淀，簡便、快捷，操作簡單，只用一步（約5～10 min）即可得到用于 PCR 擴增的 DNA模板，且質(zhì)量穩(wěn)定可靠。結(jié)合優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，可對錦鯉皰疹病毒進行快速有效診斷，具有一定應(yīng)用價值。

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